3.2. Кількісне визначення білка на основі біуретової реакції.

Серед колориметричних методів, що основані на кольорових реакціях на білки, широкого розповсюдження набув метод кількісного визначення білка за допомогою біуретового реактиву (розчину сульфату міді і сегнетової солі у NаОН певної концентрації).

Мета роботи: засвоєння методу кількісного визначення білка за допомогою біуретової реакції.

Апаратура: фотоелектроколориметр.

Лабораторний посуд: скляні палички, пробірки, піпетки.

Матеріали та реактиви: 1. Біуретовий реактив (1,5 г сульфату міді, 6 г сегнетової солі, 300 мл 10%-го розчину гідроксиду натрію розчиняють в 1 л дистильованої води); 2. 1, 2, 3, 4, 5%-ні розчини яєчного білка; 3. Розчин білка.

Принцип методу. У лужному середовищі в присутності солей міді розчини білків набувають фіолетового забарвлення, яке зумовлене наявністю у молекулі білка пептидних зв’язків, що утворюють у даних умовах мідно-–натрієві солеподібні комплекси. Інтенсивність забарвлення комплексу залежить від кількості пептидних зв'язків, а значить від кількості білка у розчині та від кількості мідної солі. Якщо додавати визначену кількість мідної солі, то ступінь забарвлення буде прямо пропорційною концентрації білка у розчині.

Хід роботи. У п'ять пробірок наливають по 2 мл стандартних розчинів білка різної концентрації, наприклад 1. 2, 3, 4, 5%-ні розчини. У шосту пробірку наливають 2 мл дослідного розчину білка, а в сьому – 2 мл дистильованої води (контроль). Потім у всі пробірки додають по 8 мл біуретового реактиву. Вміст пробірок переміщують і через 30 хв. на фотоелектроколориметрі визначають оптичну густину (D) при червоному світлофільтрі. Як контроль використовують пробу з дистильованою водою.

Результати перших п'яти проб використовують для побудови калібрувального графіка. По осі абсцис відкладають концентрацію стандартних розчинів білка, по осі ординат – відповідні їм значення оптичної густини (D). Одержані точки з'єднують прямою лінією. Визначивши значення оптичної густини дослідного розчину білка, за калібрувальним графіком знаходять його концентрацію.

3.3. Осадження білків.

А. Осадження білків реактивами на алкалоїди

Осадження білків реактивами на алкалоїди – це необоротна реакція. Алкалоїди представляють собою азотисті основи, то містять у молекулі різні гетероцикли з атомами азоту. У білковій молекулі також є деякі гетероцикли, що містять азот, тому для білків характерні деякі реакції, притаманні алкалоїдам.

Лабораторний посуд: пробірки, піпетки.

Матеріали та реактиви: 1. Розчин яєчного білка (1%-й); 2. 10%-й розчин пікринової кислоти; 3. Насичений розчин таніну; 4. 1%-й розчин гексоціано-(ІІ)-ферату калію; 5. 1,0%-й розчин оцтової кислоти.

Принцип методу. Механізм осадження білків алкалоїдними реактивами (таніном, пікринової, гексаціанової, фосфорно-вольфрамової, фосфорно-молібденової, феритової кислотами і їхніми солями) обумовлений утворенням нерозчинних сполук цих реактивів з азотистими групами білка. У таких сполуках алкалоїдні реактиви є аніонами, а білки — катіонами. Для надання молекулі білка позитивного заряду розчин білка підкислюють оцтовою кислотою. У результаті цього позитивно заряджені частки білка легко взаємодіють з негативно зарядженими молекулами осаджувача. Білки, що мають позитивний заряд (протаміни, гістони), добре осаджуються алкалоїдними реактивами в середовищі без попереднього підкислення середовища інкубації.

Хід роботи. У три пробірки вносять по 1 мл розчину яєчного білка, по 0,5 мл розчину оцтової кислоти і по 2-3 краплі: у першу – розчину пікринової кислоти, у другу – насиченого розчину таніну, у третю – розчину гексоціано-(ІІ)-ферату калію. Спостерігається випадання осаду. При додаванні надлишку розчину гексоціано-(ІІ)-ферату калію і розчину таніну осад розчиняється.

Б. Осадження білків концентрованими мінеральними кислотами

Лабораторний посуд: пробірки, піпетки.

Матеріали та реактиви: 1. Розчин яєчного білка (1%-й); 2. Концентровані азотна, сірчана і соляна кислоти.

Принцип методу. Мінеральні кислоти, крім ортофосфорної, осаджують білки в результаті денатурації і дегідратації білкових молекул. У надлишку всі мінеральні кислоти, крім азотної, розчиняють утворений осад внаслідок перезарядження білка.

Хід роботи. В одну з пробірок вносять 3 мл концентрованої азотної кислоти і по стінках пробірки обережно, щоб рідини не перемішувалися, вливають 3 мл розчину яєчного білка. На границі розділу двох рідин утворюється осад у вигляді білкового кільця (проба Гелера). Вміст перемішують, доливають надлишок азотної кислоти і переконуються, що осад не зникає.

В інші дві пробірки вносять по 3 мл розчину яєчного білка й обережно по стінці пробірки вливають в одну 2-3 краплі концентрованої сірчаної кислоти, а в другу – соляної кислоти. Випадає осад. Додають надлишок цих кислот, обережно струшують кожну пробірку і спостерігають розчинення осаду.

В. Осадження білків органічними кислотами

Лабораторний посуд: пробірки, піпетки.

Матеріали та реактиви: 1. Розчин яєчного білка (1%-й); 2. 20%-й розчин сульфосаліцилової кислоти; 3. 10%-й розчин трихлороцтової кислоти.

Принцип методу.

Деякі органічні кислоти осаджують білки в результаті денатурації і дегідратації білкових молекул, а також у результаті утворення комплексних солей білків з кислотами.

Найбільш широко для осадження білків використовують трихлороцтову (ТХО) CCl₃COOH і сульфосаліцилову HSO₄C₆H₅(OH)COOH кислоти. ТХО осаджує тільки білки і не осаджує проміжні продукти розпаду білків та амінокислоти. Сульфосаліцилова кислота осаджує не лише білки, а й високомолекулярні пептони і поліпептиди.

Хід роботи. В дві пробірки вносять по 5 мл розчину яєчного білка. В одну додають 1 мл розчину трихлороцтової кислоти, в іншу – 1 мл розчину сульфосаліцилової кислоти. В обох випадках спостерігається випадання осаду білка.

Г. Осадження білків при кип’ятінні.

Апаратура: водяна баня, газовий пальник.

Лабораторний посуд: пробірки, піпетки, скляні палички.

Матеріали та реактиви: 1. Розчин яєчного білка (1%-й), 2. 1,0%–й розчин оцтової кислоти; насичений розчин хлориду натрію, 3. 10%-й розчин гідроксиду натрію.

Принцип методу.

Стійкість білків у розчині обумовлена наявністю гідратної оболонки і певного заряду молекули білка.

Порушення факторів, що стабілізують структуру молекули білка, призводить до осадження білків. Так, при кип'ятінні більшості білків порушуються зв'язки, властиві нативному стану молекули білка.

Кращий спосіб осадження білків – кип'ятіння в середовищах, що мають значення рН, рівне ізоелектричній точці білків. Внесення в розчин білка нейтральних солей (сульфату амонію, хлориду натрію й ін.) полегшує і прискорює осадження при кип'ятінні в результаті дегідратації білкових часток.

У сильнокислих і сильнолужних розчинах білок не випадає в осад, оскільки у кислому середовищі білок завжди буде мати позитивний заряд; у лужному – негативний.

Хід роботи. У пробірку вносять 2 мл розчину яєчного білка і нагрівають на киплячій водяній бані. Спостерігають утворення осаду (згортання білка).

Щоб порівняти залежність осадження білків від концентрації водневих іонів, у п'ять пробірок вносять по 2 мл розчину яєчного білка.

Нейтральний розчин білка в першій пробірці нагрівають до кипіння, спостерігається опалесценція (помутніння), обумовлена руйнуванням гідратної оболонки навколо молекули білка і збільшення білкових часток. Але міцели білка несуть заряд і тому залишаються в розчині, не випадаючи в осад.

Розчин у другій пробірці нагрівають до кипіння, вливають 1 мл 1%-го розчину оцтової кислоти до слабокислої реакції. При стоянні білок випадає в осад. У цих умовах частки білка втрачають заряд, тому що рН середовища близька до ізоелектричного стану.

У третю пробірку вносять 1 мл 10%-го розчину оцтової кислоти для створення кислої реакції середовища. При кип'ятінні розчину осад не утворюється, тому що молекули білка здобувають позитивний заряд, що підвищує їх стійкість.

У четверту пробірку додають 1 мл розчину оцтової кислоти, кілька краплин насиченого розчину хлориду натрію і нагрівають. Випадає білий осад. Його утворення обумовлене тим, що білок при взаємодії з іонами хлориду натрія втрачає свій заряд.

У п'яту пробірку вносять 1 мл 10%-го розчину гідроксиду натрію для створення лужного середовища. При кип'ятінні рідину осад не утворюється, тому що в лужному середовищі збільшується негативний заряд білка.

Результати щодо випадіння осаду заносять до таблиці, форма якої наведена нижче:

Нейтральне середовище	Слабокисле середовище	Кисле середовище	Кисле середовище + електроліт	Лужне середовище