5.3. Вплив активаторів та інгібіторів на активність амілази.

Принцип методу. Активатором амілази є хлорид натрію, а інгібітором – сульфат міді. Ступінь гідролізу крохмалю під впливом амілази буде різним в присутності цих речовин.

Хід роботи. Готують розчин слини; відміряють циліндром 50 1 л дистильованої води і полощуть нею рот протягом 3–5 хвилин у кілька прийомів. Одержану рідину фільтрують через вату і фільтрат використовують. Беруть три пробірки. В першу наливають 2,5 мл води, в другу – 2 мл води і 0,5мл 1%-го розчину хлориду натрію, в третю – 2 мл води і 0,5 мл 1%-го розчину сульфату міді. У всі пробірки вносять по 2,5 мл розчину слини і додають по 2,5 мл 0,5% розчину крохмалю; знову перемішують і ставлять у термостат при температурі 38°С. Через 5 хвилин пробірки виймають і перевіряють ступінь гідролізу крохмалю, додаючи у всі пробірки по 5 крапель розчину йоду. Рідина у першій пробірці забарвлюється у фіолетовий або червоний колір, у другій – у червоний або жовтий, в третій – у синій. Результати свідчать про те, що найкраще гідроліз крохмалю проходить у другій пробірці (хлорид натрію – активатор амілази), а найгірше – у третій (сульфат міді – інгібітор амілази).

Реактиви: 1. Розчин слини (готують студенти перед роботою); 2. 0,5%-й розчин крохмалю; 3. 0,1%-й розчин йоду в 0,2%-му розчині йодиду калію; 4. 1%-й розчин NaCl; 5. 1%-й розчин CuSO₄.

5.4. Якісне визначення β-фруктофуранозидази.

Фермент β–фруктофуранозидаза (інвертаза, сахараза) належить до класу гідролаз. Він каталізує гідролітичне розтоплення вуглеводів, які містять фруктозу у –формі, розщеплюючи β–фруктозидний зв’язок (сахарозу, рафінозу).

Гідроліз сахарози супроводжується утворенням α–глюкози і β–фруктози. Цей фермент має значне поширення в природі, особливо активний він у дріжджах. Інвертаза знаходить застосування в кондитерській промисловості, оскільки утворений під її дією інверсний цукор перешкоджає кристалізації сахарози в кондитерських виробах.

Принцип методу. Наявність β-фруктозидази визначають за редукуючим цукром, який утворюється під час ферментативного гідролізу сахарози. Альдегідна група редукуючого цукру реагує з гідроксидом міді Cu(OH)₂. Редукуючі цукри при цьому окислюються у відповідні кислоти, а голубий гідрат окису міді відновлюється в жовтий гідрат закису міді СuОН .

Фруктоза в розчині Фелінга переходить в альдозу під дією лугу та окислюється в кислоту, яка містить на один атом вуглецю менше, ніж вихідний цукор.

Реакцію відновлення міді та окислення альдегідної групи цукру можна подати таким чином, що альдегідна група редукуючого цукру окислюється в кислоту: R–COH + O  R–COOH за рахунок кисню гідрату окису міді

2Cu(OH)₂  2CuOH + O + H₂O

При нагріванні: 2CuOH  H₂O + Cu₂O

Хід роботи. 5 г свіжих пресованих дріжджів вміщують у фарфорову ступку, куди додають 3 г добре промитого дрібного піску. Потім додають 2 мл води і розтирають протягом 5 хв. У розтерту масу в кілька прийомів приливають, при ретельному перемішуванні, ще 10 мл дистильованої води. Суміш залишають стояти протягом 20 хв. у термостаті при 25–30°С і час від часу струшують. Суміш центрифугують, центрифугат іноді дає опалесценцію, що пояснюється вмістом у ньому деякої кількості глікогену.

В дві пробірки наливають по 5 мл розчину сахарози в буфері. Потім швидко приливають по 1 мл центрифугату екстракту інвертази: в одну пробірку – накип'яченого, в другу – попередньо прокип'яченого протягом 5 хв. і охолодженого. Суміші ставлять на 30 хв. у термостат при 40°С. Після вказаного терміну інкубації приливають по 2 мл фелінгового розчину (по 1 мл розчинів І і ІІ). Рідину в пробірках кип'ятять. Там, де був доданий кип'ячений центрифугат, осад закису міді майже не випадає. В окремих випадках може спостерігатися незначний червоний наліт на дні пробірки: це пояснюється тим, що розчин сахарози містить деяку кількість редукуючих цукрів, або тим, що в ферментному екстракті можуть також міститися редукуючі речовини. В другій пробірці, де фермент активний, випадає значний червоний осад закису міді, який свідчить про ферментативне розщеплення сахарози.

Паралельно рекомендують поставити ще один дослід на специфічність інвертази. В третю пробірку наливають як субстрат не тростинний цукор, а 5 мл 1%-го розчину крохмалю у воді і додають 1 мл некип'яченого центрифугату. Суміш інкубують у термостаті при температурі 40°С. Потім додають 2 мл фелінгової рідини, по 1 мл розчинів І і ІІ, кип'ятять і спостерігають за процесом. У цьому випадку осаду закису міді не буде, що вказує на специфічну дію сахарози.

Реактиви: 1. Розчин тростинного цукру в буфері (рН 4,5): В колбу місткістю 1 л наливають 50 мл нормального розчину оцтовокислого натрію та 50 мл нормального розчину оцтової кислоти і доводять водою до мітки. В мірній колбі місткістю 1 л розчиняють буферною сумішшю 100 г тростинного цукру і доводять вміст колби цією ж сумішшю до мітки. Розчин зберігають на холоді (2–4°С) або консервують толуолом, додаючи його близько 1 мл; 2. Реактив Фелінга: Розчин І. 40 г перекристалізованої сірчанокислої міді розчиняють у мірній колбі місткістю 1 л і доводять водою до мітки. Розчин П. 200 г сегнетової солі (подвійна сіль калію) і натрію винної кислоти KNaC₄H₄O₆4H₂O і 150 г хімічно чистого їдкого натру розчиняють у мірній колбі місткістю 1 л і доводять водою до мітки. Розчини І і П при проведенні реакції приливають в однакових кількостях; 3. 1,0%-й розчин крохмалю у воді.