5.5. Визначення амілолітичної активності.

Амілази каталізують гідроліз високомолекулярних полісахаридів крохмалю і глікогену. Найважливішим джерелом амілаз є злакові, які містять їх як у непророщеному, так і (особливо багато) в пророщеному зерні. В останньому випадку амілази мають високу активність.

Широке застосування амілази знаходять у крохмало–патоковому, спиртовому, пивоварному і хлібопекарному виробництвах як головні ферменти, що каталізують процеси розщеплення крохмалю й утворення бродильного цукру.

Амілолітична активність характеризує здатність ферментів каталізувати гідроліз крохмалю до декстринів, які не забарвлюються йодом. Метод характеризує активність α-амілази, але при наявності в препараті β-амілази і глюкоамілази цим методом визначають сумарну дію всіх амілолітичних ферментів.

За одиницю амілолітичної активності прийнято таку кількість ферменту, яка каталізує розщеплення 1 г розчинного крохмалю до декстринів, які не забарвлюються йодом за 1 год при 30°С у чітко визначених умовах.

Амілолітичну здатність препарату (АЗ) виражають числом указаних одиниць в 1 г сухого препарату чи в 1 мл розчину. При такому способі вираження АЗ безпосередньо показує, скільки грамів крохмалю може бути прогідролізовано до нездатних забарвлюватися йодом декстринів 1 г препарату, культури чи 1 мл розчину за 1 год (в умовах, аналогічних умовам визначення).

Принцип методу грунтується на гідролізі 1,0%-го буферного розчину крохмалю. Кінець реакції контролюється візуально за йодною пробою. За часом, протягом якого проходить розщеплення крохмалю до продуктів, що не забарвлюються йодом, визначається амілолітична активність препарату,

Хід роботи. В конічну колбу на 50–100 мл вносять піпеткою 20 мл 1,0%-го розчину крохмалю і поміщають у термостат з температурою 30°С. Загальний об'єм реакційної суміші завжди повинен бути рівний 30 мл, і якщо на аналіз беруть менше 10 мл ферментного розчину, об’єм, кого нестає доповнюість дистильованою водою, яку приливають перед додаванням ферментного розчину.

Через 10 хв витримки в термостаті в колбу вносять ферментний розчин при ретельному перемішуванні і точно за секундоміром відмічають час.

За початок реакції приймають час, коли з піпетки виллється половина вмісту. Через кожну хвилину після початку реакції або частіше скляною паличкою відбирають краплину суміші і на білій порцеляновій пластинці з'єднують її з раніше нанесеною краплиною робочого розчину йоду.

Реакція розщеплення крохмалю вважається закінченою, коли йод перестане змінювати забарвлення на синє при з’єднанні з краплиною дослідної рідини (протягом перших 10 с).

Час, за який проходить розщеплення крохмалю до продуктів, що не забарвлюються йодом, може становити від 3 до 20 хв., але більш надійні результати отримують у межах від 5 до 15 хв. Всі піпетки, які використовуються при аналізі, повинні мати ватні тампони (для запобігання попадання слідів слини).

Примітка. Якщо час зникнення забарвлення менше 3 хв., то визначення повторюють з меншою кількістю розчину ферменту, наприклад – 2 мл. У цьому випадку в пробірку чи колбу з 20 мл крохмалю вносять 3 мл дистильованої води. Під час аналізу дуже активних препаратів концентрації розчинів роблять меншими (0,1г в 200 або 500 мл).

Якщо час зникнення забарвлення становить більше 20 хв., то готують розчин ферменту більшої концентрації, наприклад, 1:50 чи 1:100, а рідину можна нерозбавляти зовсім.

При часі зникнення забарвлення в межах 3–5 хв. проби відбирають кожні 15 с; 5–10 хв. – кожні 30 с; а більше 10 хв. – кожну хвилину.

Скляну паличку після кожної проби промивають дистильованою водою і витирають чистим некрохмаленим рушником.

Розрахунок амілолітичної активності (амілолітичної здатності – А3)

Розрахунок АЗ проводиться за формулою:

де 0,2 – кількість крохмалю в реакційній суміші, г; 60 – коефіцієнт перерахунку на 1 год; а – кількість ферментного препарату, введеного в реакційну суміш у грамах абсолютно сухої речовини або мілілітрах рідинного об'єкта; t – час, за який пройшло розщеплення крохмалю до нездатних забарвлюватися йодом продуктів, хв; 1 – перерахунок на 1 г абсолютно сухого препарату або 1 мл розчину.

Приклад розрахунку. Для аналізу беруть 5 мл ферментного розчину з розбавленням 1:2000, що відповідає 0,0026 г препарату

.

Забарвлення з йодом зникає через 6,5 хв., тоді за формулою:

Реактиви: 1. 1,0%-й розчин розчинного крохмалю (картопляного). Наважку беруть з такого розрахунку, щоб в 100 мл розчину був 1 г сухого крохмалю. Наважку крохмалю кількісно переносять у велику склянку з киплячою водою, кип’ятять 2 хв. й охолоджують, весь час перемішуючи розчин скляною паличкою. Охолоджений крохмаль переносять у мірну колбу того об’єму, з розрахунку на який взята наважка крохмалю, додають буферний розчин (2) в кількості 10 мл на 100 мл розчину і доводять до мітки дистильованою водою. Розчин крохмалю готують у день аналізу; 2. буферний розчин: змішують рівні об’єми нормальних розчинів оцтової кислоти (58 мл льодяної оцтової кислоти в 1 л дистильованої води (оцтовокислого натрію) 82 г СH₃СООNа або 136 г CH₃COONa3H₂О в 1 л води), рН = 4,7; 3. Робочий розчин йоду (1,4 г кристалічного йоду і 4,4 г йодистого калію розчиняють у малому об’ємі води, та об’єм розчину доводять до 100 мл., зберігають у темному місці); 4. робочий розчин йоду готують в день аналізу (20 мл основного розчину йоду доводять дистильованою водою до 100 мл і на кожні 100 мл робочого розчину додають 4 г йодистого калію); 5. розчин ферменту: а) Для технічного ферментного препарату (культура гриба) із ретельно подрібненої абсолютно сухої середньої проби беруть у колбу на 200–300 мл наважку 1 г (з точністю до 0,01), додають піпеткою 50–100 мл дистильованої води і настоюють протягом 1 год. при кімнатній температурі, перемішуючи через кожні 10 хв.; по закінченні 1 год. розчин фільтрують через складчастий фільтр; б) Для очищених ферментних препаратів: на аналітичних вагах беруть наважку середньої проби тонко подрібненого препарату в 0,1 г. Препарат ретельно розтирають скляною паличкою в невеликій кількості води, потім переносять в мірну колбу на 100 мл і доводять дистильованою водою до риски; розчин фільтрують.