Тема 9. Генетика микроооганизмов. Перечень конкретных учебно-целевых вопросов

1. Особенности организации генетического материала у микроорганизмов. Плазмиды бактерий и их характеристика.

2. Модификационная изменчивость у бактерий.

3. Мутации у бактерий, их классификация, механизмы. Процессы репарации у бактерий.

4. Рекомбинационная изменчивость у бактерий. Трансдукция, трансформация, конъюгация и их механизмы.

5. Принципы генетического картирования бактерий.

6. Принципы генной инженерии, аспекты практического применения.

7. Понятие о биотехнологии.

8. Генетический метод диагностики инфекционных заболеваний. Методы молекулярной гибридизации. Полимеразная цепная реакция.

Информация к занятию

Генетика микроорганизмов.

Изменчивость у бактерий может носить фенотипический (модификации) или генотипический (мутации) характер.

Модификации представляют собой фенотипические ненаследуемые изменения, возникающие при действии ряда факторов на генетически однородные микроорганизмы.

Мутации характеризуются наследуемыми изменениями в генетическом аппарате микроорганизма и, соответственно, в его биологических свойствах. Спонтанные мутации могут иметь неблагоприятный исход для микроба. Вместе с тем, мутационная изменчивость в сочетании с методами селекции открывает широкие возможности для поиска полезных микроорганизмов. Применение мутагенов позволило получить высокоактивные продуценты антибиотиков и аминокислот. Методами отбора были созданы живые вакцины против полиомиелита, кори, туберкулеза и др.

К рекомбинационным видам изменчивости у бактерий относятся трансформация, конъюгация и трансдукция.

Трансформация – это процесс переноса генетической информации бактерии-реципиенту с помощью ДНК бактерии-донора. Этим генетическим приемом можно передать вирулентность, устойчивость к антибиотикам, способность синтезировать различные вещества и др.

Трансдукция – это процесс переноса генетической информации от бактерии-реципиента клетке-донору с помощью бактериофага, например, способности синтезировать какой-либо фермент.

Конъюгация – процесс, при котором передача генетического материала происходит при непосредственном контакте двух микробных клеток. При этом из бактерии-донора (F+ или Hfr) в бактерию-реципиент переходит F-плазмида (нехромосомный фактор наследственности в виде короткой цепочки ДНК), которая придает бактерии-реципиенту новое свойство, например, устойчивость к антибиотикам, способность продуцировать определенные аминокислоты, белки, факторы роста и т.д. Метод конъюгации создает широкие перспективы для создания рекомбинантных культур микроорганизмов, применяемых для получения лекарственных средств. В настоящее время сконструированы штаммы Е. coli, в геном которых встроены гены, контролирующие синтез интерферона, инсулина, других гормонов. В геном дрожжей введен ген вируса гепатита В, ответственный за выработку иммуногенного HB_sAg, что использовано для производства генно-инженерной вакцины для профилактики этого заболевания.

Молекулярно-генетические методы идентификации микроорганизмов

Эти методы основываются на анализе нуклеиновых кислот микроорганизмов.

1. Рестрикционный анализ. Сущность метода заключается в обработке ДНК рестрикционными ферментами (специфическими эндонуклеазами), разрезающими молекулу ДНК по определенным последовательностям нуклеотидов. После этого анализируют полученные фрагменты, специфические для каждого вида или варианта микроорганизма.

2. Гибридизация ДНК. Метод основан на определении уникальных последовательностей генома микроорганизма, отражающих свойства вида или варианта. Сущность обнаружения таких участков ДНК основана на способности комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот к гибридизации. Исследование проводят с помощью меченых ферментом, радионуклидом или флюорохромом нуклеиновых зондов, представляющих однонитевые фрагменты ДНК, комплементарные уникальным участкам микробного генома. Основной областью применения является идентификация трудно культивируемых или медленно растущих микробов (например, представителей родовMycobacterium,Neisseria,Campylobacter).Метод молекулярной гибридизации требует большого количества молекулярных зондов, времени, сложен в постановке, не отличается высокой чувствительностью и широкого практического применения не нашел.

3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).Метод ПЦР позволяет обнаруживать уникальные (специфические) участки ДНК, находящиеся в исследуемом образце в очень малых количествах. Сущность ПЦР основана на амплификации (увеличении) числа копий искомого участка генома микроорганизма, причем для идентификации вида микроорганизма теоретически достаточно одной копии искомой уникальной последовательности. С этой целью образец инкубируют в буферном растворе с двумя короткими ДНК-олигомерами (праймерами), комплементарными концам известного уникального фрагмента генома, термостабильной ДНК-полимеразой и нуклеотидами. После гибридизации олигомеров с комплементарными участками ДНК они служат праймерами для полимеразы, которая копирует искомый фрагмент. Образец многократно (20-40 раз) нагревают для разделения цепей двойной спирали ДНК и охлаждают для повторной гибридизации праймеров с комплементарной матрицей, при этом каждая копия участка ДНК становится новой матрицей для синтеза следующей копии. Количество копий искомого фрагмента генома в результате амплификации в специальном приборе – амплификаторе (рис. 27,см. приложение) экспоненциально увеличивается. Амплификация в миллионы раз занимает всего несколько часов. Определение амплифицированной ДНК осуществляется либо электрофорезом в геле с помощью специального оборудования (рис. 28,см. приложение) с последующим окрашиванием пробы флюоресцентным красителем и регистрацией результатов электрофореза в приборе – трансиллюминаторе (рис. 29,см. приложение), либо флюориметрическим методом (в этом случае зонды и/или праймеры имеют флюоресцентную метку, которая учитывается на приборе- флюориметре – рис 30,см. приложение).

ПЦР широко используется в диагностических целях. Достоинства ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний заключаются в следующем:

1. ПЦР дает прямые указания на присутствие возбудителя в исследуемом материале без выделения чистой культуры.

2. Метод обладает очень высокой чувствительностью (от нескольких до одного возбудителя в пробе) и 100% специфичностью. Количество исследуемого материала может составлять несколько десятков микролитров.

3. Исследуемый материал может быть дезинфицирован с помощью химических или термических методов, что исключает инфицирование персонала в процессе проведения ПЦР.

1. Простота исполнения, возможность полной автоматизации, быстрота получения результатов (4-5 часов) позволяет отнести ПЦР к экспресс-методам диагностики.