Микробиологическая диагностика бактериальных пневмоний и острых респираторных заболеваний (орз)

Основным возбудителем (около 60%) бактериальных пневмоний в настоящее время является пневмококк (Streptococcus pneumoniae), реже (30-40%) – клебсиеллы (Klebsiella pneumoniae), хламидии (Chlamydophila pneumoniae), микоплазмы (Mycoplasma pneumoniae), стафилококк(Staphylococcus aureus), гемофильные палочки (Haemophilus influenzae), легионеллы(Legionella pneumophila).

Подходы к лабораторной диагностике бактери­альных пневмоний и ОРЗ, независимо от вида возбудителя, принципиально, одинаковы.

Материалом для исследования являются мокрота, отделяемое слизистой оболочки трахеи и бронхов, промывные воды бронхов, экссудат из плев­ральной полости, кровь, спинномозговая жидкость при менин­гите, отделяемое зева и носа при ОРЗ.

Микроскопический метод (микроскопия мазков из исследуемого материала, окрашенных по Граму) имеет ориентировочное значение. Наличие в препаратах значительного количества удлиненных ланцетовидных, грамположительных диплококков, окруженных капсулой (Streptococcus pneumoniae – рис. 19), скоплений грамположительных кокков в виде гроздьев (S.aureus) или грамотрицательных коккобактерий(H.influenzae)позволяет поставить пред­варительный диагноз бактериальной пневмонии и служить ориентиром для назначения антибактериальной терапии.

Рис. 19. Пневмококк (Streptococcus pneumoniae). Окраска по Граму. х 900

Бактериологическое исследование явля­ется ведущим методом диагностики пневмоний и ОРЗ бактериальной этиологии, которое дает возможность не только выделить возбудителя инфекции, но и определить его чувствительность к антибиотикам.

Для выделения пневмококка (Streptococcus pneumoniae) осуществляют посев исследуемого материала на МПБ с глюкозой и на кровяной МПА. Посевы выращивают в термостате при 37⁰ С в течение суток. Выросшие на кровяном МПА нежные колонии окружены зеленоватой зоной гемолиза. Из колоний готовят мазок, изучают морфологические и тинкториальные свойства, после чего остаток колонии пересевают на скошенный кровяной МПА или сахарный (или сывороточный) МПБ с целью выделения чистой культуры и ее идентификации на основании комплекса биологических свойств.

Дифференциация S.pneumoniae и S.pyogenes основывается на проверке чувствительности выделенной культуры к желчи и оптохину, а также способности ферментировать инулин.

Серотипирование пневмококка проводится с помощью РА на стекле с использованием типоспецифических пневмококковых сывороток (известно около 90 серова­ров пневмококка, из которых 23 играют важную роль в патологии человека). Для серотипирования пневмококков может использоваться реакция Нейфельда (фено­мен набухания капсулы стрептококка в присутствии типоспецифической сыворотки).

Для изоляции клебсиелл выполняют посев исследуемого материала на МПА с пенициллином (для подавления сопутствующей микрофоры) в чашках Петри или на дифференциально-диагностические среды с лактозой и индикатором бром-тимоловым синим, на которых спустя сутки культивирования при 37⁰ С образуются блестящие выпуклые слизистые колонии (на дифференциально-диагностической среде колонии имеют желтый цвет в результате разложения лактозы). На 2 день колонии исследуют визуально и с помощью микроскопического метода (окраска по Граму и Гинсу-Бурри для выявления капсул), после чего пересевают типичные колонии на среду Ресселя или скошенный МПА для выделения чистой культуры возбудителя. На 3 день учитывают рост на указанных средах (окрашивание столбика и скошенной части среды Ресселя в желтый цвет с разрывами агара в результате расщепления глюкозы и лактозы с образованием газа) и проводят идентификацию культуры клебсиелл по основным биологическим свойствам (образование капсулы, отсутствие подвижности, биохимические и антигенные свойства).

Для выделения микоплазм производят посев на специальные питательные среды с добавлением сыворотки, на которых они не ранее чем через месяц после образуют характерные микроскопические колонии с ровными краями и зернистой структурой. Выделенную чистую культуру микоплазм идентифицируют по биохими­ческим и антигенным свойствам.

Выделение легионелл, являющихся медленно рас­тущими микроорганизмами, осуществляют с применением селективных питательных сред сложного состава, содержащих дрожжевой экстракт и другие факторы роста, а также различные антибиотики для подавления роста сопутст­вующей микрофлоры. Легионеллы относятся к медленно растущим микроорганизмам, однако микроколонии, видимые под мик­роскопом, появляются на 2-е сутки роста, тогда как макроскопически видимые мелкие колонии (2-4 мм) правильной округлой формы, с ровными краями и блестящей поверхностью с характерным ро­зовым или сине-зеленым ободком и опалесцирующим центром - через 3-5 суток. Идентификацию выделенной чистой культуры до уровня рода проводят на основании изучения биологических свойств. Для видовой идентификации разработаны ИФМ, газожидкостная хрома­тография, генодиагностика (рестрикционный анализ, метод ДНК-зондов).

Серологический метод диагностики пневмоний, вызванных пневмококками, микоплазмами, хламидиями и легионеллами при исследовании парных сывороток крови больных (в остром периоде и в стадию реконвалесценции) с помощью РСК, РНГА, ИФА не является клинически обязательным и имеет эпидемиологическое значение. Для определения антител к легионеллам используют, кроме того, непрямой ИФМ с антигеном из легионелл (диагностический титр 1:32 и более).

Экспресс-методы. Разработан иммуноферментный тест для определения в моче специфичного антигена легионелл, а также иммунохроматографический тест для выявления в моче пневмококкового антигена, однако широкое применение этих методов ограничено.

Генодиагностика. Предложена ПЦР для диагностики хламидиозов и микоплазмозов, однако метод широко в клинической практике не используется.

Биопроба. Исследуемый материал для выделения пневмококков вводят внутрибрюшинно белым мышам или морским свинкам. Культуру пневмококка выделяют из крови и органов погибшего или забитого животного, а также проводят бактериоскопию мазков-отпечатков, сделанных из его органов. В настоящее время метод практически не применяется.