Самостоятельная работа студентов

1. Бактериологический метод. Изучить этапы выделения чистой культуры возбудителя:

• Учет посевов фекалий от больного с подозрением на эшерихиоз на средах Эндо, Левина, Ресселя, Олькеницкого, скошенном MПA (демонстрация).

• Провести контроль чистоты выделенной культуры. Со ско­шенного МПА приготовлен мазок, окрашен по Граму. Промикроскопировать и зарисовать демон­страционный препарат кишечной палочки. Escherichia coli – беспорядочно расположенные грамотрицательные палочки с закругленными краями.

• Идентификация выделенной культуры возбудителя по антигенным свойствам. Учесть ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с комплексной ОВ-коли сывороткой (О-111, О-55, О-26) и типовыми О-коли сыворотками О-III, 0-55, О-26. Учесть развернутую реакцию агглютинации, по­ставленную с живой и кипяченой культурами и типовой сывороткой, с которой была положительная ориентировочная реакция агглютинации (демонстрация). Положительное заклю­чение выдается только при положительной РА с убитой культурой (обнаружение специфического О-антигена).

2. Серологический метод. Учет демонстрационных реакций (РА, РНГА, ИФА) в парных сыворотках больных с целью определения нарастания титра антител к возбудителям эшерихиозов.

3. Биопрепараты для диагностики эшерихиозов: типовые агглютинирующие 0-коли сыворотки 0-111,0-55, 0-26.

Микробиологическая диагностика иерсиниозов

Энтеропатогенные иерсинии (Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis) вызывают кишечные инфекции, характеризующиеся поражением лимфоидного аппарата кишеч­ника, токсико-аллергическими осложнениями, развитием генерализованных процессов.

Микробиологическая диагностика иерсиниозов включает бактериологическое и серологическое исследования.

Бактериологическое исследование. Материал, подлежащий исследованию (фекалии, кишечные биоптаты, лимфоузлы или ткань удаленного аппендикса, кровь, слизь из ротоглотки), об­рабатывают в течение 1 минуты 0,5% раствором гидроксида ка­лия в 0,5% хлориде натрия, затем делают посевы на агар CIN, Серова или среду Эндо, которые после посева инкубируют при 32 °С в течение 24—48 ч или 24 ч при 37⁰ С и столько же при комнатной температуре. Параллельно посевы помещают в холодильник при температуре +4⁰ С (иерсинии хорошо растут при низ­ких температурах). Пересевы со среды накоп­ления выполняют на 3, 5, 10, 15-е сутки на указанные выше питательные среды.

На 2-й (3-й) день изучают первичные посевы. Энтеропатогенные иерсинии образуют более мелкие колонии, чем прочие энтеробактерии, на средеCIN колонии имеют красный центр и бесцветную периферию («бычий глаз»), на среде Эндо колонии бесцветные или с более интенсивно окрашенным центром. У Y. enterocolitica и у Y. pseudotuberculosis часто наблюдается диссоциация колоний с переходом в R (шероховатые) формы. Характерные для иерсиний ко­лонии пересевают для накопления чистой культуры на скошенный МПА или на среду Ресселя или Олькеницкого.

На 3-й (4-й) день проводят идентификацию чистой культуры по биохимическим и антигенным свойствам (биовар, серогруппа с помощью РА у культур, выращенных при температуре ниже 30⁰ С), учитывают тем­пературу физиологического оптимума иерсиний (28-30⁰ С), определяют чувствительность к анти­биотикам. Воз­будители иерсиниоза и псевдотуберкулеза оксидазоотрицательны, ферментируют до кислоты глю­козу, обладают нитратредуктазой и другими свойствами (см. табл. 5).

В отличие от возбудителя псевдотуберкулеза, бактерии вида Y. enterocolitica по биологическим свойствам гетерогенны, включая безусловно-патогенные, условно-патогенные (возбудители оппортунистической инфекции или пищевого отравления) и непатогенные для человека иерсинии. Определение факторов виру­лентности у Y. enterocolitica предполагает постановку реакций аутоагглютинации и кальцийзависимости, пиразинамидазного теста, определение плазмидассоциированных антигенов.

Тест аутоагглютинации. В две пробирки со средой Кларка за­севают исследуемый штамм, инкубируют в течение 24 ч одну пробирку при 37⁰ С, другую - при 26 - 28⁰ С. При наличии вирулентности бактерии, выращенные при температуре 37⁰ С, склеиваются в виде хлопьев, оседающих на дно и стенки пробирки. Культура, инкубированная при температуре 26 – 28⁰ С, не агглютинируется.

Определение пиразинамидазной активности. На скошенную среду с пиразинамидом, засевают исследуемые культуры, выращенные при температуре 25-30⁰ С на ПА, инкубируют при той же температуре в течение 48 часов, после чего смачивают скошенную поверхность раствором суль­фата аммонийного железа, оставляя пробирку при комнатной температуре в течение 15 мин. В пробирках с культурами патогенных иер­синий цвет среды остаются без изме­нений; непатогенные иерсинии меняют цвет скошенной части среды на коричневый.

Тест кальцийзависимости ставят на кальций-дефицитном агаре, который готовят путем добавления раствора оксалата натрия к расплавленному МПА. После перемешивания вносят 4 мл 0,5М раствора хлорида магния. Исследуемую культуру засевают на 2 чашки с кальций-дефицитным агаром, одну чашку инкубируют 24 — 48 часов при 37⁰ С, другую - при 26 - 28⁰ С. При наличии вирулентности при дефиците кальция у клеток, инкубированных при 37 °С (но не 26 – 28⁰ С), прекращается рост бактерий, при этом колонии на чашке либо имеют карликовые размеры (Y. enterocolitica), либо отсутствуют совсем (чаще у Y. pseudotuberculosis). При 26 – 28⁰ С так же, как у непатогенных иерсинии при двух температурных режимах, на­блюдается рост колоний обычных размеров.

Серологическое исследование заключается в постановке РА, РНГА или ИФА с иерсиниозными диагностикумами и парными сыворотками крови больных с подозрением на иерсиниоз с целью определения специфических антител.

Генодиагностика – обнаружение типичных фрагментов ДНК патогенных иерсиний в клиническом материале или пищевых продуктах мето­дами ДНК-ДНК-гибридизация или ПЦР-анализа.