42. Биотехнология нативной спермы. Оценка сперматозоидов по морфологическим признакам

Оценка морфологии сперматозоидов (сперматограмма) проводится на неокрашенных препаратах, после обездвиживания в счетной камере. Морфологическая структура сперматозоидов является важным критерием диагностического звена, поскольку наряду с подвижностью этот параметр определяет фертильность спермы. Исследование желательно проводить при помощи фазово-контрастного микроскопа. Анализируется тот же препарат, что и для оценки подвижности клеток.

Проводится подсчет общего числа сперматозоидов в 5 больших квадратах камеры. При этом вначале можно определить число сперматозоидов с ненарушенной подвижностью и нормальным морфологическим строением. Затем изучается процент этих сперматозоидов от общего числа. Также для исследования приготавливается окрашенный препарат (мазок). Для этого используют предметные стекла, которые обезжириваются путем обработки 70 градусным спиртом. На высушенное стекло наносится капля эякулята после полного разжижения. Капля разносится по поверхности стекла с помощью другого, краем, под углом в 45 градусов. Необходимо этот процесс осуществлять деликатно, что бы не допустить раздавливания препарата. Распределение материала на стекле происходит за счет капиллярных сил.

Микроскопия вначале проводится при малом увеличении. В норме в поле зрения микроскопа должно быть не менее 30 сперматозоидов, равномерно распределенных по стеклу. Окраска препарата выполняется гематоксилин-эозином. Также используется метод окраски по Папаниколау, Шору иМай-Грюнвальду-Гимзе. Исследование наиболее информативно при окраске по Папаниколау.

Мазки микроскопируют при большом увеличении 900х (иммерсионный объектив 90х, окуляр 10х). Процент морфологически нормальных сперматозоидов определяется по формуле: N / C х 100%, где C это число всех подсчитанных сперматозоидов, а N – число сперматозоидов с нормальной морфологией.

Общее число аномальных сперматозоидов вычисляется следующим образом: C – N. Эта цифра принимается за 100% для подсчета в процентном соотношении сперматозоидов с различной формой аномалии. Например, для подсчета сперматозоидов с аномалией головки в процентах используется формула G / C – N х 100% , где G – это число сперматозоидов с атипией головки, C - это число всех подсчитанных сперматозоидов, а N – число сперматозоидов с нормальной морфологией. Точно таким же образом идет подсчет числа сперматозоидов с патологией шейки и жгутика.

Затем определяется индекс тератозооспермии (количество дефектов, разделенное на общее число аномальных сперматозоидов). 

43. Методика замораживания спермы и хранения ее в жидком азоте

Заморозка необлицованных гранул .Разбавленную сперму охлаждают до 2-5ºС в течение 3-4 часов, а затем разливают градуированными пипетками, полиэтиленовым шприцем или разливочной машиной в лунки охлажденной в жидком азоте фторопластовой пластины. Пластину выдерживают над жидким азотом на расстоянии 5-10 см в течение 1,5-2 мин, а затем погружают е в жидкий азот на 1-2 мин. После замораживания спермы пластину вынимают из жидкого азота, гранула собирают сачком и пересыпают в охлажденный контейнер, который помещают в сосуд Дьюара с жидким азотом для хранения. Уровень азота в сосудах должен быть значительно выше чашек с замороженной спермой. Перед осеменением из чашек пинцетом достают охлажденные до -196ºС гранулы, размораживают их. Оценивают активность спермиев и используют для осеменения коров при активности не ниже 4 баллов.

Заморозка облицованных гранул.  (по Осташко) замораживают сперму, разбавленную средами №1 и 2. Приготовленные среды наливают в стерильные полиэтиленовые флаконы по 200-400 мл, которые подсоединяют к специальному устройству для разбавления. Сперму сначала разбавляют средой №1 в соотношении 1:1 и выдерживают при комнатной температуре 5-10 минут, затем средой №2 до требуемой концентрации (15 млн в 1 дозе).

Сперму разбавляют с помощью устройства благодаря которому можно дозировано вводить среды в отдаленную часть одноразового полиэтиленового спермоприемника со спермой. Заполненную спермой трубку разделяют с помощью автомата ПРЖ на дозы 0,25-0,33 мл и герметизируют путем термической сварки. Облицованные гранулы помещают в алюминиевые тубы и оставляют в холодильнике (2-5ºС) в течение 4-6 часов для эквилибрации. Затем обоймы с тубами в сосуд Дьюара. Активность спермиев после замораживания спермы проверяют через 24 часа. Из каждой тубы берут гранулу и размораживают при t 40ºС. Упаковку протирают и определяют активность (между стеклами). Для дальнейшего хранения в жидком азоте допускается сперма с активностью не ниже 4 баллов.

Заморозка в полипропиленовых трубочках, или соломинках (пайетах) происходит предварительно разбавленной спермой так, чтобы после разморозки в соломинке было не менее 15 млн подвижных спермиев. Каждую соломинку маркируют: указывают наименование предприятия, кличку и номер быка, дату получения спермы. Разбавленную сперму расфасовывают по 0,25 мл с помощью машины, которая автоматически заполняет спермой соломинки и закупоривает их с обоих концов стерильными шариками (синие пробки). Один шарик служит пробкой-поршнем, а другой герметизирует соломинку. Штативы с соломинками кладут в пластмассовые коробки, которые переносят в холодильник и выдерживают при 4ºС в течение 3-4 часов. После охлаждения оценивают подвижность спермиев и к замораживанию допускается сперма с активностью не ниже 8 баллов. Сперму в соломинках хранят в пластмассовых стаканах на 500 и 150 доз в жидком азоте.