26. Криоконсервация спермы. Краткая история и значение метода

Благодаря открытию переживаемости  спермы при низких температурах, оказалось ее можно хранить несколько лет и даже десятилетий, перевозить на любые расстояния, а, главное, всегда иметь на станциях сперму лучших производителей.

Биология заморозки. При температурах выше 0ºС обменные процессы в сперме хотя и замедляются, но не прекращаются. Продолжается накопление вредных продуктов распада и начинается процесс разрушения передней части головки спермия  - акросомы, которая выполняет важную функцию при оплодотворении яйцеклеток. Удлинить сроки хранения спермы можно путем еще большего замедления обменных процессов, для чего необходимо охладить ее до отрицательных температур. Но уже при  -0,6ºС сперма начинает замерзать. Основная причина ее гибели – кристаллич. замерзание воды. Если сперму охлаждать медленно, то вся вода, содержащаяся в ней, успеет превратиться в ледяные кристаллы и спермии погибнут. При быстром охлаждении удается «миновать» зону кристаллизации и достичь зоны витрификации, где протоплазма спермиев затвердевает как единое целое без вымерзания воды и образования кристаллов льда. Глубокое охлаждение спермы до температуры жидкого азота достигается в течение нескольких минут.

История криоконсервации сперматозоидов человека О сохранении подвижности сперматозоидов по­сле их замораживания и оттаивания первым сооб­щил Спаланцани в 1776 г. В середине XIX в. возникла идея хранения сперматозоидов, используемых для размножения скота.Примерно тогда же рассматри­валась возможность замораживания сперматозои­дов солдат, чтобы в случае их гибели на войне жены могли бы родить от них ребенка. Серьезная разра­ботка методов криоконсервации сперматозоидов началась в первой половине XX в. Существенный прогресс обеспечило приме­нение первого криопротектора — глицерина, защи­щающего и сохраняющего функции сперматозоидов при замораживании. Уже вскоре появилось первое сообщение об успешном оплодо­творении и индукции беременности с помощью криоконсервированных сперматозоидов.

27. Криоконсервация спермы. Методика криоконсервации

Благодаря открытию переживаемости  спермы при низких температурах, оказалось ее можно хранить несколько лет и даже десятилетий, перевозить на любые расстояния, а, главное, всегда иметь на станциях сперму лучших производителей. Биология заморозки. При температурах выше 0ºС обменные процессы в сперме хотя и замедляются, но не прекращаются. Продолжается накопление вредных продуктов распада и начинается процесс разрушения передней части головки спермия  - акросомы, которая выполняет важную функцию при оплодотворении яйцеклеток.

Удлинить сроки хранения спермы можно путем еще большего замедления обменных процессов, для чего необходимо охладить ее до отрицательных температур. Но уже при  -0,6ºС сперма начинает замерзать. Основная причина ее гибели – кристаллическое замерзание воды. Если сперму охлаждать медленно, то вся вода, содержащаяся в ней, успеет превратиться в ледяные кристаллы и спермии погибнут. При быстром охлаждении удается «миновать» зону кристаллизации и достичь зоны витрификации, где протоплазма спермиев затвердевает как единое целое без вымерзания воды и образования кристаллов льда. Глубокое охлаждение спермы до температуры жидкого азота достигается в течение нескольких минут.

Замораживание спермы быка. Для замораживания в жидком азоте пригодна сперма с концентрацией спермиев не менее 0,8 млрд/мл и активностью не ниже 8 баллов. Заморозка на фторопластовых пластинах в форме гранул.

После получения и оценки сперму разбавляют  лактозо (11,5 мл) – желточной (20 мл) средой с глицерином (5 мл). Сперму разбавляют в 10-30 раз в зависимости от объема гранул.

Если объем гранул 0,1-0,2 мл, то необходимы меньше степени разбавления и тогда на пункте искусственного осеменении сперму перед использованием надо разбавить: для этого гранулы размораживают во флаконе до 38-40ºС. Сперму, предназначенную для размораживания в гранулах объемом 0,5 мл, разбавляют в 10 раз и больше и перед осеменением коров две  гранулы помещают в стерильный флакон и погружают его в теплую воду (38-40ºС).

Заморозка необлицованных гранул .Разбавленную сперму охлаждают до 2-5ºС в течение 3-4 часов, а затем разливают градуированными пипетками, полиэтиленовым шприцем или разливочной машиной в лунки охлажденной в жидком азоте фторопластовой пластины. Пластину выдерживают над жидким азотом на расстоянии 5-10 см в течение 1,5-2 мин, а затем погружают е в жидкий азот на 1-2 мин. После замораживания спермы пластину вынимают из жидкого азота, гранула собирают сачком и пересыпают в охлажденный контейнер, который помещают в сосуд Дьюара с жидким азотом для хранения. Уровень азота в сосудах должен быть значительно выше чашек с замороженной спермой. Перед осеменением из чашек пинцетом достают охлажденные до -196ºС гранулы, размораживают их. Оценивают активность спермиев и используют для осеменения коров при активности не ниже 4 баллов.

Заморозка облицованных гранул.  (по Осташко) замораживают сперму, разбавленную средами №1 и 2. Приготовленные среды наливают в стерильные полиэтиленовые флаконы по 200-400 мл, которые подсоединяют к специальному устройству для разбавления. Сперму сначала разбавляют средой №1 в соотношении 1:1 и выдерживают при комнатной температуре 5-10 минут, затем средой №2 до требуемой концентрации (15 млн в 1 дозе).

Сперму разбавляют с помощью устройства благодаря которому можно дозировано вводить среды в отдаленную часть одноразового полиэтиленового спермоприемника со спермой. Заполненную спермой трубку разделяют с помощью автомата ПРЖ на дозы 0,25-0,33 мл и герметизируют путем термической сварки. Облицованные гранулы помещают в алюминиевые тубы и оставляют в холодильнике (2-5ºС) в течение 4-6 часов для эквилибрации. Затем обоймы с тубами в сосуд Дьюара. Активность спермиев после замораживания спермы проверяют через 24 часа. Из каждой тубы берут гранулу и размораживают при t 40ºС. Упаковку протирают и определяют активность (между стеклами). Для дальнейшего хранения в жидком азоте допускается сперма с активностью не ниже 4 баллов.

Заморозка в полипропиленовых трубочках, или соломинках (пайетах) происходит предварительно разбавленной спермой так, чтобы после разморозки в соломинке было не менее 15 млн подвижных спермиев. Каждую соломинку маркируют: указывают наименование предприятия, кличку и номер быка, дату получения спермы. Разбавленную сперму расфасовывают по 0,25 мл с помощью машины, которая автоматически заполняет спермой соломинки и закупоривает их с обоих концов стерильными шариками (синие пробки). Один шарик служит пробкой-поршнем, а другой герметизирует соломинку. Штативы с соломинками кладут в пластмассовые коробки, которые переносят в холодильник и выдерживают при 4ºС в течение 3-4 часов. После охлаждения оценивают подвижность спермиев и к замораживанию допускается сперма с активностью не ниже 8 баллов. Сперму в соломинках хранят в пластмассовых стаканах на 500 и 150 доз в жидком азоте.