III. Определение белка по содержанию общего азота

Определение белка по содержанию общего азота основано на том, что содержание азота в большинстве белков практически одинаково и может быть принято равным 16%. В том случае, если лекарственный препарат, кроме белка, содержит другие вещества, в состав которых входит азот, белок предварительно осаждают трихлоруксусной или хлорной кислотой. При нагревании органического соединения с концентрированной серной кислотой происходит его минерализация, азот превращается в аммония сульфат, и его можно определить количественно.

1. Микрометод Кьельдаля

Определение проводят в соответствии со статьей "Определение азота в органических соединениях" (ГФ XI, вып. 1, с. 180) со следующими дополнениями: навеску препарата, содержащую 10-20 мг испытуемого белка, помещают в колбу "в", затем осторожно прибавляют 0,25 г растертой смеси калия сульфата, меди сульфата и натрия селената, взятых в соотношении 20:5:8,5, и 2 мл концентрированной серной кислоты. Проводят минерализацию, нагревая колбу на горелке или плитке, пока раствор не станет прозрачным. После этого продолжают нагревание еще в течение 30 мин. В конце минерализации, когда вся вода испарится, прибавляют 1-2 капли пергидроля и продолжают нагревание в течение 10 мин до обесцвечивания раствора. Отгон титруют раствором хлористоводородной кислоты (0,01 моль/л).

Параллельно проводят контрольный опыт.

Разность между количеством миллилитров раствора хлористоводородной кислоты (0,01 моль/л) в испытуемом и контрольном опытах, умноженная на 0,14 г, соответствует количеству миллиграммов азота во взятой навеске. Принимая содержание азота в белке равным 16%, по количеству найденного азота рассчитывают количество белка в опытной пробе.

2. Определение белка с реактивом Несслера

Навеску препарата, содержащую около 10 мг белка, минерализуют по способу, описанному в микрометоде Кьельдаля. После минерализации пробу количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора водой до метки.

0,5-1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 10 мл воды, 2 мл реактива Несслера и доводят объем раствора водой до метки. Через 15 мин измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 410 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют смесь этих же реактивов без препарата.

Калибровочный график строят в пределах концентраций от 30 до 60 мкг азота с использованием в качестве стандартного образца аммония сульфата, высушенного до постоянной массы в эксикаторе над серной кислотой.

Принимая содержание азота в белке равным 16%, по количеству найденного азота рассчитывают количество белка в опытной пробе.

Примечания. Приготовление биуретового реактива: 0,75 г меди сульфата и 3 г натрия - калия тартрата растворяют в 250 мл воды в мерной колбе вместимостью 1 л, затем при энергичном перемешивании прибавляют 150 мл 10% раствора натра едкого, свободного от углекислоты, 1 г калия йодида, перемешивают и доводят объем раствора водой до метки.

Раствор хранят в емкости из полиэтилена.

Приготовление реактива Бенедикта. 17,3 г натрия цитрата и 10 г натрия карбоната безводного растворяют при нагревании в 50 мл воды (не доводя до кипения), прибавляют 10 мл 17,3% раствора меди сульфата, перемешивают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки.

Приготовление 17,3% раствора меди сульфата: 17,3 г меди сульфата растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки.

Приготовление реактива I: состоит из двух растворов.

1. 4 г натра едкого растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1 л, прибавляют 20 г натрия карбоната и доводят объем раствора водой до метки.

2. 1 г меди сульфата растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки; 2 г натрия тартрата (ГОСТ 5845-79, ч. д. а.) или натрия цитрата растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки. Оба раствора сливают при перемешивании.

Реактивом I служит смесь 49 мл раствора 1 и 1 мл раствора

2. Готовят перед употреблением.

Приготовление реактива II. 1 мл раствора 2 помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят 2% раствором натрия карбоната до метки.

Приготовление 2% раствора натрия карбоната: 2 г натрия карбоната помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в воде и доводят объем раствора до метки водой.

Приготовление 1% раствора натрия дезоксихолата:

1 г натрия дезоксихолата (ТУ 6-09-10-1292-78) растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки.

Приготовление реактива Бредфорд: 0,05 г кумасси ярко - голубого G-250 растворяют в мерной колбе вместимостью 500 мл в 25 мл 95% спирта, прибавляют 50 мл 85% раствора кислоты ортофосфорной и доводят объем раствора водой до метки.

Раствор хранят в сосуде из оранжевого стекла не более 10 сут.

Приготовление раствора кумасси ярко - голубого G-250: 0,06 г кумасси ярко - голубого G-250 растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл в растворе хлористоводородной кислоты (0,6 моль/л) и доводят объем раствора той же кислотой до метки, фильтруют. Оптическая плотность полученного раствора при длине волны 465 нм должна быть не менее 1,3 и не более 1,5.

Приготовление раствора бромфенолового синего:

0,0075 г бромфенолового синего водорастворимого (ТУ 6-09-3719-83) растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл в 15 мл 95% спирта, прибавляют 2,5 мл ледяной уксусной кислоты, перемешивают и доводят объем раствора водой до метки.

Приготовление натрий - цитратного буферного раствора рН 5,0: в колбу вместимостью 1 л помещают 400 мл воды, 5 мл кислоты хлористоводородной концентрированной, 41,7 г натрия цитрата, перемешивают при нагревании до полного растворения, затем прибавляют 1 г фенола, перемешивают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1 л и доводят объем раствора водой до метки.

Раствор хранят при температуре от 4 до 10 град. С в течение 15 сут.

Приготовление нингидринового реактива: в сосуд из оранжевого стекла вместимостью 1 л помещают 375 мл монометилового эфира этиленгликоля (ТУ 6-09-08-4398-77), прибавляют 125 мл натрий - ацетатного буферного раствора рН 5,5, при перемешивании на магнитной мешалке пропускают азот в течение 10 мин, затем прибавляют 10 г нингидрина и вновь пропускают азот в течение 10 мин, продолжая перемешивание на магнитной мешалке до полного растворения нингидрина. После этого прибавляют 0,19 г олова двухлористого 2-водного и перемешивают.

Хранят реактив в сосуде из оранжевого стекла при температуре от 4 до 10 град. С не более 15 сут.

Приготовление натрий - ацетатного буферного раствора рН 5,5: 82 г натрия ацетата плавленого (ТУ 6-09-246-70) растворяют при перемешивании в мерной колбе вместимостью 250 мл в 140 мл воды, прибавляют 25 мл ледяной уксусной кислоты и доводят объем раствора водой до метки.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИНКА В ПРЕПАРАТАХ ИНСУЛИНА

Спектрофотометрический метод. В две мерные колбы вместимостью 50 мл помещают: в одну - 5 мл препарата или раствора инсулина, или 1,5 мл надосадочной жидкости (для суспензии инсулина), в другую - 5 мл разбавленного раствора стандартного образца цинка. В каждую колбу прибавляют по 10 мл буферного раствора (рН 9,0), 3 мл раствора цинкона и доводят объем растворов водой до метки. Растворы перемешивают и через 1 ч измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 620 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм по сравнению с контрольным раствором, приготовленным с теми же реактивами.

Содержание цинка (X) в препарате или надосадочной жидкости в миллиграммах на 100 ЕД инсулина вычисляют по формуле:

D1 х 0,001 х 50 х 2,5

Х = ----------------------

D0 х V

где D1 - оптическая плотность испытуемого раствора препарата или надосадочной жидкости; D0 - оптическая плотность разбавленного раствора стандартного образца цинка; 0,001 - содержание цинка в миллиграммах в 1 мл измеряемого разбавленного раствора стандартного образца цинка; 2,5 - количество препарата в миллилитрах, содержащего 100 ЕД инсулина (при содержании инсулина 40 ЕД в 1 мл препарата); V - объем препарата, раствора инсулина или надосадочной жидкости в миллилитрах, взятых для анализа.

Примечания. 1. Приготовление раствора инсулина: навеску инсулина, содержащую 400 ЕД, растворяют в растворе хлористоводородной кислоты (0,01 моль/л) в мерной колбе вместимостью 10 мл и доводят объем раствора этим же раствором хлористоводородной кислоты до метки.

2. Приготовление надосадочной жидкости суспензии: содержание флакона (5 мл) тщательно перемешивают, вносят в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 10 мин со скоростью 4000-6000 об/мин.

3. Приготовление раствора стандартного образца цинка: 0,4400 г цинка сульфата растворяют в мерной колбе вместимостью 1 л в небольшом количестве свежепрокипяченной и охлажденной воды и доводят объем раствора этой же водой до метки. Раствор стандартного образца цинка содержит 0,1 мг цинка в 1 мл.

Срок годности раствора 14 сут, хранение при температуре 4 - 8 град. С.

4. Приготовление разбавленного раствора стандартного образца цинка: 10 мл раствора стандартного образца цинка помещают в колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора свежепрокипяченной и охлажденной водой до метки. Разбавленный раствор стандартного образца цинка содержит 0,01 мг цинка в 1 мл.

Раствор должен быть свежеприготовленным.

5. Приготовление раствора борной кислоты (0,2 моль/л) с калия хлоридом. 12,3670 г перекристаллизованной борной кислоты и 14,9110 г калия хлорида растворяют в свежепрокипяченной и охлажденной воде в мерной колбе вместимостью 1 л и доводят объем раствора этой же водой до метки.

Срок годности раствора 30 сут, хранение при температуре 4 - 8 град. С.

6. Приготовление буферного раствора рН 9,0 (потенциометрически): 50 мл раствора борной кислоты (0,2 моль/л) с калия хлоридом помещают в мерную колбу вместимостью 200 мл, прибавляют 21,3 мл раствора натра едкого (0,2 моль/л) и доводят объем раствора свежепрокипяченной и охлажденной водой до метки.

Раствор должен быть свежеприготовленным.

7. Приготовление раствора цинкона: 0,13 г цинкона (ТУ-6-0907-315-85 или фирмы "Хемапол", ЧССР) растирают в ступке с 2 мл раствора натра едкого (1 моль/л), количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора свежепрокипяченной и охлажденной водой до метки и фильтруют.

Раствор должен быть свежеприготовленным.

Определение цинка в препаратах инсулина с протамином. 5 мл тщательно перемешанного препарата помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают; 5 мл полученного раствора и 5 мл разбавленного раствора стандартного образца цинка помещают в две другие мерные колбы вместимостью по 50 мл. В каждую колбу прибавляют по 1 мл раствора хлористоводородной кислоты (0,1 моль/л), 10 мл буферного раствора (рН 9,0), 1 мл раствора натра едкого (0,1 моль/л) и 2 мл 0,01% раствора трипсина. Растворы перемешивают и выдерживают 10 мин при комнатной температуре, затем в каждую колбу приливают по 3 мл раствора цинкона и доводят объем раствора водой до метки. Полученные растворы перемешивают и через 1 ч измеряют оптическую плотность, как указано выше.

Содержание цинка (X) в препарате в миллиграммах на 100 ЕД инсулина вычисляют по формуле:

D1 х 0,001 х 50 х 2,5 х 50

Х = ----------------------------

D0 х 5 х 5

где D1 - оптическая плотность испытуемого раствора препарата; Dо - оптическая плотность разбавленного раствора стандартного образца цинка; 0,001 - содержание цинка в миллиграммах в 1 мл измеряемого разбавленного раствора стандартного образца цинка; 2,5 - количество препарата в миллилитрах, содержащего 100 ЕД инсулина (при содержании инсулина 40 ЕД в 1 мл препарата).

Примечания. 1. Приготовление 0,01% раствора трипсина: 0,01 г трипсина растворяют в растворе хлористоводородной кислоты (0,001 моль/л) в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора этим же раствором хлористоводородной кислоты до метки.

Раствор должен быть свежеприготовленным.

2. Приготовление раствора хлористоводородной кислоты (0,001 моль/л): 100 мл раствора хлористоводородной кислоты (0,01 моль/л) точно отмеривают из бюретки в мерную колбу вместимостью 1 л. Объем раствора в колбе доводят водой до метки.

Срок годности раствора 6 мес.

Метод атомной абсорбции. Определение цинка в препаратах инсулина проводят на атомно - абсорбционных спектрофотометрах при длине волны 214 нм в соответствии с ГФ XI (вып. 1, с. 42).

Цинк в инсулине. Готовят раствор инсулина в хлористоводородной кислоте (0,01 моль/л) с содержанием 1 мг инсулина в 1 мл и проводят определение.

Цинк в растворе. 5 мл препарата помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора водой до метки и проводят определение.

Общий цинк в суспензиях: 2,5 мл хорошо перемешанной суспензии помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 0,5 мл хлористоводородной кислоты (0,1 моль/л), доводят объем раствора водой до метки и проводят определение.

Цинк в надосадочной жидкости. Содержимое флакона (5 мл) тщательно перемешивают, вносят в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 10 мин со скоростью 4000-6000 об/мин. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 1,5 мл надосадочной жидкости, доводят объем раствора водой до метки и проводят определение.

Расчет содержания цинка в препаратах инсулина проводят по градуировочной кривой.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНСЕРВАНТОВ В ГОРМОНАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТАХ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕНОЛА

Метод броматометрического титрования. 5 мл препарата помещают в коническую колбу вместимостью 150 мл с притертой пробкой, прибавляют раствор 0,25 г калия бромида в 25 мл воды. 15 мл (точный объем) раствора калия бромата (0,1 моль/л), 2,5 мл разведенной серной кислоты перемешивают, закрывают колбу пробкой и оставляют в темном месте на 15 мин. После этого к смеси прибавляют 1 г калия йодида, перемешивают, снова оставляют на 5 мин и титруют раствором натрия тиосульфата (0,1 моль/л) (индикатор - крахмал).

Параллельно проводят контрольный опыт.

1 мл раствора натрия тиосульфата (0,1 моль/л) соответствует 0,001568 г фенола.

Содержание фенола в препарате в процентах (X) вычисляют по формуле:

(а - б) х 0,001569 х 100

Х = --------------------------

в

где а - количество раствора натрия тиосульфата (0,1 моль/л), пошедшее на титрование в контрольном опыте, в миллилитрах, б - количество раствора натрия тиосульфата (0,1 моль/л), пошедшее на титрование испытуемого препарата, в миллилитрах, в - количество препарата, взятого для анализа, в миллилитрах.

Метод газовой хроматографии. Используют газовый хроматограф с пламенно - ионизационным детектором, хроматографическая колонка 100х0,3 см, заполненная сорбентом с 5% полиэтиленгликоля 6000 или 20 М на промытом кислотой и силанизированном носителе "Хроматон N" с размером частиц 0,125-0,250 мм (возможно применение других носителей типа "Хромосорб", "Инертон" тех же квалификаций). Температура колонки, узла ввода пробы, детектора 140, 200, 250 град. С соответственно. Скорость газа - носителя (азот) 20-50 мл/мин. Величина вводимой пробы (2-5 мкл) определяется чувствительностью детектора.

Содержание фенола в препарате определяют методом абсолютной калибровки или методом внутреннего стандарта, в качестве которого используют бензиловый спирт (ГОСТ 8751-72, ч. д. а.).

При использовании метода внутреннего стандарта к препарату в количестве около 2 г (точная навеска) прибавляют около 0,005 г бензилового спирта (точная навеска), смесь перемешивают и хроматографируют.

Содержание фенола в препарате в процентах (X) вычисляют по формуле:

KS1P2 х 100

Х = ------------

S2P1

где S1 - площадь пика фенола; S2 - площадь пика бензилового спирта; Р1 - навеска препарата в граммах; Р2 - навеска бензилового спирта в граммах; К - калибровочный коэффициент.

Калибровочный коэффициент определяют на 3-4 калибровочных смесях фенола и бензилового спирта.

Для метода абсолютной калибровки график строят по 4-5 калибровочным смесям с концентрацией фенола от 0,10 до 0,50%.

Примечание. 1. Определение калибровочного коэффициента (К): фенол и бензиловый спирт, взятые в количествах около 0,125 г (точные навески), помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют навески в 25-30 мл воды, доводят объем раствора водой до метки и хроматографируют. Рассчитывают среднее значение калибровочного коэффициента не менее чем из 3 определений по формуле:

S2 x Рх

К = ---------,

S1 x P2

где Рх - навеска фенола в граммах.

2. Приготовление калибровочных смесей: 0,050; 0,100; 0,150; 0,200; 0,250 г фенола (точные навески) вносят соответственно в 5 мерных колб вместимостью 50 мл. Навески растворяют в 20 мл воды и доводят объем раствора водой до метки. Срок годности растворов - 14 сут при хранении при температуре от 4 до 8 град. С.

3. Приготовление суспензий к анализу: во флакон с суспензией вносят 1-2 капли хлористоводородной кислоты и встряхивают.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИПАГИНА

Метод газовой хроматографии. Используют газовый хроматограф с пламенно - ионизационным детектором, хроматографическую колонку 50 х 0,3 см, заполненную сорбентом 5% неопентилгликольсукцината на промытом кислотой и силанизированном носителе "Хроматон N" с размером частиц 0,125-0,250 мм (возможно применение других носителей типа "Хромосорб", "Инертон" тех же квалификаций). Температура колонки, узла ввода пробы и детектора 170, 220, 240 град. С соответственно. Скорость газа - носителя (азот) 20-50 мл/мин. Пробу вводят непосредственно в хроматографическую колонку; ее величина определяется чувствительностью детектора (2-5 мкл).

Содержание нипагина в препарате определяют методом абсолютной калибровки или методом внутреннего стандарта, в качестве которого используют нипазол (ТУ 6-09-4727-79).

При использовании метода внутреннего стандарта к препарату или к подготовленной к анализу суспензии в количестве около 5 мл (точная навеска) прибавляют 1 мл раствора внутреннего стандарта, раствор тщательно перемешивают, отбирают пробу и хроматографируют.

Содержание нипагина в препарате в процентах (X) вычисляют по формуле:

KS1 x P2

Х = --------- x 100,

S2 x P1

где S1 - площадь пика нипагина; S2 - площадь пика нипазола; Р1 - навеска препарата в граммах; Р2 - навеска нипазола в граммах; К - калибровочный коэффициент.

Калибровочный коэффициент определяют на 3-4 искусственных смесях нипагина и нипазола с равными концентрациями компонентов.

Для метода абсолютной калибровки график строят по 4-5 искусственным смесям с концентрацией нипагина от 0,05 до 0,15%.

Примечания. 1. Определение калибровочного коэффициента: нипагин и нипазол, взятые в количествах по 0,050 г (точные навески), помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 5 мл спирта, растворяют и доводят объем раствора водой до метки и хроматографируют. Рассчитывают среднее значение калибровочного коэффициента не менее чем из 3 определений по формуле:

S2 x Рх

К = ---------,

S1 x P2

где Рх - навеска нипагина в граммах.

Раствор должен быть свежеприготовленным.

2. Приготовление калибровочных смесей: 0,025; 0,040; 0,050; 0,060; 0,075 г нипагина (точные навески) вносят соответственно в 5 мерных колб вместимостью 50 мл. В каждую колбу прибавляют по 2,5 мл 95% спирта, растворяют навеску и доводят объем раствора водой до метки.

Раствор должен быть свежеприготовленным.

3. Приготовление раствора внутреннего стандарта: около 0,125 г нипазола (точная навеска) вносят в мерную колбу с притертой пробкой вместимостью 25 мл, прибавляют 10 мл 95% спирта, растворяют и доводят объем раствора 95% спиртом до метки.

Срок годности раствора 14 сут при хранении при температуре от 4 до 8 град. С.

4. Приготовление суспензий к анализу: во флакон с суспензией вносят 1-2 капли хлористоводородной кислоты и встряхивают.

МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

ВИТАМИНОВ В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМАХ