1. Определение ретинола ацетата

и ретинола пальмитата (витамина А)

а) Точную навеску порошка растертых драже (не более 1 г) или 2 таблетки, покрытые оболочкой и растертые в порошок, количественно переносят 15 миллилитрами предварительно свежепрокипяченной и охлажденной до температуры 40 град. С воды в коническую колбу вместимостью 100 мл, нагревают на водяной бане при температуре от 60 до 70 град. С при перемешивании в течение 5 мин, прибавляют 8 мл раствора аммиака и нагревают при той же температуре в течение 15 мин. Затем прибавляют 30 мл 95% спирта, 3 мл 50% раствора едкого кали и нагревают в течение 30 мин на водяной бане с обратным холодильником при температуре кипения смеси. Содержимое колбы тотчас охлаждают до комнатной температуры, количественно переносят 50 мл воды в делительную воронку и извлекают 150 мл эфира для наркоза в течение 2 мин. В случае образования эмульсии проводят дополнительное извлечение эфиром 3 раза по 25 мл. Объединенные эфирные извлечения промывают сначала 30 мл воды, затем 50 мл 4% раствора едкого кали и снова водой по 50 мл до исчезновения щелочной реакции промывных вод (проба с фенолфталеином). Промытые эфирные извлечения количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 мл, доводят объем раствора эфиром до метки и перемешивают; 5 мл полученного раствора помещают в коническую колбу вместимостью 50 мл. Эфир отгоняют в токе азота или под вакуумом на водяной бане при температуре не выше 40 град. С. Остаток растворяют в пропаноле - 2 до получения концентрации витамина А около 2 мкг (6 ME) в 1 мл.

Измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длинах волн 300, 310, 325, 334 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют пропанол - 2.

Отношение значения оптической плотности при длине волны 300 нм к значению оптической плотности при длине волны 325 нм не должно превышать 0,73.

Вычисляют оптическую плотность D325 (испр.) с поправкой на сопутствующие витамину А примеси по следующему уравнению:

D325 (испр.) = 6,185 х D325 - 2,555 х D310 - 4,260 х D334,

где D325, D310 и D334 - оптические плотности испытуемого раствора при соответствующих длинах волн.

Если D325 (испр.) не отличается от D325 больше чем на +/-5%, то содержание витамина А в ME в одной таблетке или драже (X) вычисляют по формуле:

D325 х 250 х V х 3330000 х б D325 х V х 915 х б

Х = ---------------------------- = --------------------

а х 5 х 100 х 1820 а

где D325 - оптическая плотность испытуемого раствора при длине

волны 325 нм; 250; 5 и V - разведения в миллилитрах; 3330000 -

количество витамина А в ME, соответствующее одному грамму 100%

ретинола; а - навеска препарата в граммах или количество таблеток,

покрытых оболочкой; б - средняя масса одного драже в граммах; 1820

1%

удельный показатель поглощения (Е ) 100% ретинола в пропаноле -

1 см

2 при длине волны 325 нм.

Если D325 (испр.) отличается от D325 больше чем на +/- 5%, содержание витамина А в ME в одном драже или таблетке вычисляют по вышеприведенной формуле, подставляя вместо D325 величину D325 (испр.).

б) При наличии в составе испытуемого препарата альфа - токоферола ацетата (витамина Е) дополнительно проводят гидрирование. Для этого промытые эфирные извлечения, полученные, как указано выше, упаривают в токе азота или под вакуумом на водяной бане при температуре не выше 40 град. С. Остаток тотчас растворяют в пропаноле - 2 до получения концентрации ретинола около 20 мкг (60 ME) в 1 мл (раствор А).

15 мл раствора А переносят в колбу для гидрирования вместимостью 50 мл, прибавляют около 0,2 г палладиевого катализатора, перемешивают и гидрируют в течение 15 мин в приборе, изображенном на рис. 5. <*>

--------------------------------

<*> Рис. 5. Прибор для гидрирования.

а - газометр с водородом; б - бюретка, снабженная тройным краном; в - колба для гидрирования; г - магнитная мешалка. (Рисунок не приводится).

При проведении гидрирования водород из газометра а забирают в бюретку б, снабженную тройным краном и заполненную водой. Сначала тройной кран поворачивают так, чтобы провести забор водорода из газометра, после чего кран газометра закрывают, а тройной кран бюретки поворачивают так, чтобы водород из бюретки поступал в колбу для гидрирования, снабженную небольшой вводной трубкой. Перемешивание раствора при гидрировании проводят с помощью магнитной мешалки.

Для вытеснения воздуха из колбы через всю систему 3 раза пропускают водород. После заполнения системы водородом колбу закрывают пробкой, включают магнитную мешалку и ведут гидрирование при комнатной температуре. Расход водорода на гидрирование наблюдают по уменьшению объема водорода в бюретке.

Примечание. Проба на полноту гидрирования: 1 мл фильтрата помещают в фарфоровую чашку и удаляют растворитель упариванием на закрытой водяной бане. Остаток растворяют в 1 мл хлороформа, прибавляют 5 мл раствора сурьмы хлорида; не должно появляться синего окрашивания. В случае появления окраски гидрирование продолжают в течение более длительного времени, прибавляя катализатор.

По окончании гидрирования в колбу прибавляют 0,3 г силикагеля марки КСМ или ШСМ, перемешивают и фильтруют; 3 мл фильтрата помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора пропанолом - 2 до метки и перемешивают (раствор Б).

3 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора пропанолом - 2 до метки и перемешивают (раствор В).

Измеряют оптическую плотность раствора В на спектрофотометре при длинах волн 300, 310, 325, 334 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют раствор Б.

Содержание витамина А в ME в одной таблетке или драже вычисляют, как описано выше, введя в формулу расчета разведение в пропаноле - 2.

Примечания. 1. При анализе таблеток, покрытых оболочкой, средняя масса таблетки в формуле не учитывается.

2. При анализе препаратов, не содержащих аскорбиновую кислоту, перед омылением прибавляют к испытуемой навеске 0,1 г аскорбиновой кислоты.

3. 1 г 100% ретинола ацетата соответствует 2907000 ME. 1 г 100% ретинола пальмитата соответствует 1817000 ME.

4. Пропанол-2 (изопропиловый спирт) (х. ч.) при измерении поглощения должен иметь величину оптической плотности, не превышающую 0,01 в области от 320 до 350 нм и 0,05 - от 280 до 300 нм по сравнению с водой в кювете с толщиной слоя 10 мм.

5. Очистка азота: азот газообразный (ос. ч.) пропускают последовательно через поглотители со щелочным раствором пирогаллола А [5 г пирогаллола А (ч. д. а.) на 100 мл 20% раствора едкого кали], концентрированной серной кислотой, стеклянной ватой и плавленым кальция хлоридом.

6. Приготовление палладиевого катализатора: в трехгорлую колбу вместимостью 1,5-2 л с мешалкой помещают 840 мл воды, 100 мл концентрированного раствора аммиака и 210 г аммония карбоната (х. ч. или ч. д. а.).

При непрерывном перемешивании реакционную массу нагревают до температуры 50 град. С и в течение 30 мин прибавляют раствор, полученный растворением 52,5 г кальция карбоната (ч. д. а.) в смеси 130 мл концентрированной кислоты хлористоводородной с 130 мл воды. Температуру реакционной массы поддерживают от 50 до 80 град. С. Выделившийся белый осадок отфильтровывают и тщательно промывают водой до исчезновения запаха аммиака. После этого осадок отжимают. В колбу с суспензией свежеосажденного кальция карбоната в 400 мл воды прибавляют при интенсивном перемешивании горячий раствор, полученный растворением 5 г палладия хлорида (ч. д. а. или ч.) в смеси 12 мл концентрированной хлористоводородной кислоты с 30 мл воды. Смесь перемешивают 10 мин, затем нагревают от 80 до 85 град. С и при этой температуре перемешивают в течение 15 мин. Горячую смесь насыщают водородом (марки А) в течение 6 ч. Приготовленный катализатор промывают водой до отсутствия ионов хлора. Получают около 43 г палладированного кальция карбоната, который сушат при температуре от 100 до 105 град. С до постоянной массы. Хранят в банке оранжевого стекла при комнатной температуре. Годен в течение 3 мес.