1. Колориметрические методы определения белка

При определении белка в лекарственных препаратах при помощи колориметрических методов предварительно строят калибровочный график с использованием стандартного образца белка, указанного в частных статьях (бычьего сывороточного альбумина, сывороточного альбумина человека или аминокислоты тирозина).

При определении белка в испытуемых пробах соблюдают те же условия проведения реакций и измерения поглощения растворов, что и при построении калибровочного графика.

1. Определение белка с биуретовым реактивом

Метод основан на образовании в щелочной среде окрашенного в фиолетовый цвет комплекса ионов двухвалентной меди с пептидными связями молекулы белка.

Биуретовую реакцию нельзя проводить в присутствии солей аммония из-за образования медно - аммиачных комплексов.

1 мл раствора препарата, содержащего 1-10 мг испытуемого белка, помещают в пробирку, прибавляют 4 мл биуретового реактива, перемешивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Оптическую плотность раствора измеряют на спектрофотометре при длине волны в диапазоне от 540 до 650 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют смесь этих же реактивов без препарата.

Калибровочный график строят в пределах концентраций от 1 до 10 мг стандартного образца белка, измеряя оптическую плотность растворов при выбранной длине волны.

2. Микроопределение белка с реактивом Бенедикта

Принцип метода тот же, что и при определении белка с биуретовым реактивом.

2 мл раствора препарата, содержащего 0,1-2 мг испытуемого белка, помещают в пробирку, прибавляют 2 мл 6% раствора натра едкого, 0,2 мл реактива Бенедикта, перемешивают и оставляют на 15 мин при комнатной температуре. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при длине волны 330 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют смесь этих же реактивов без препарата.

Калибровочный график строят в пределах концентраций от 0,1 до 2 мг стандартного образца белка, измеряя оптическую плотность раствора при 330 нм.

3. Определение белка по методу Лоури

Метод основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот и цистеина с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи.

1 мл раствора препарата, содержащего 0,025-0,250 мг испытуемого белка, помещают в пробирку, прибавляют 2 мл реактива 1 и оставляют при комнатной температуре на 10 мин. Затем прибавляют 0,5 мл реактива Фолина, перемешивают и через 30-40 мин измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 750 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют смесь этих же реактивов без препарата.

Калибровочный график строят в пределах концентраций от 0,025 до 0,250 мг стандартного образца белка, измеряя оптическую плотность растворов при 750 нм.

4. Определение белка по методу Лоури

в модификации Сяткина

Метод Лоури в модификации Сяткина используют для определения содержания белка в препаратах с повышенным содержанием липо- и гликопротеидов.

0,1 мл раствора препарата, содержащего 0,5-2,5 мг испытуемого белка, помещают в пробирку, прибавляют 0,8 мл раствора натра едкого (1 моль/л) и 0,1 мл 1% раствора натрия дезоксихолата, затем прибавляют 4 мл реактива II, смесь перемешивают. После просветления раствора прибавляют 0,5 мл реактива Фолина, немедленно перемешивают и оставляют на 30 мин в темном месте при комнатной температуре. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при длине волны 750 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют смесь этих же реактивов без препарата.

Калибровочный график строят в пределах концентраций от 0,5 до 2,5 мг стандартного образца белка, измеряя оптическую плотность растворов при 750 нм.