12. Приготовление микропрепарата. Принцип окраски по Граму. Грамположительные и грамотрицательные бактерии

1 Этап: приготовление мазка

- взять предметное стекло и обжечь в пламени горелки

- восковым карандашом отметить пределы будущего мазка

- положить предметное стекло на рельсы

- прокалить бактериальную петлю

- бактериальной петлей нанести в середину окружности каплю ИХН

- в каплю ИХН внести культуру бактерий

- тщательно эмульгировать смесь

- распределить смесь тонким слоем в пределах окружности

(Мазки из бульонных культур готовят без нанесения ИХН)

2 Этап: высушивание

- стекло оставляют на воздухе до исчезновения влаги

3 Этап: фиксация

Проводят для того, чтобы убить микроб, прикрепить его к предметному стеклу, повысить восприимчивость к красителю

- предметное стекло трижды накладывают на пламя горелки

4 Этап: окраска по Граму

- красить генцианвиолетом две минуты через фильтровальную бумагу

- слить краску с препарата

- налить раствор Люголя на 1 мин

- слить реактив

- обесцветить препарат: погрузить несколько раз в 96% спиртовой раствор йода

- промыть препарат водой

- окрасить разведенным фуксином 1 мин

- промыть водой

- высушить препарат фильтровальной бумагой

- микроскопировать

13. Методы окраски микропрепаратов. Дифференциальные методы окраски, практическое применение

Методы окраски. Окраску мазка производят просты­ми или сложными методами. Простые за­ключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю — Нильсену и др.) включают последо­вательное использование нескольких красителей и имеют диффе­ренциально-диагностическое значение. Отношение микроорганиз­мов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.

При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, ис­пользуя красители анилинового ряда (основные или кис­лые). Если красящий ион (хромофор) — катион, то краситель обладает основными свойствами, если хромо­фор - анион, то краситель имеет кислые свойства. Кис­лые красители — эритрозин, кислый фуксин, эозин. Ос­новные красители — генциановый фиолетовый, кристал­лический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин. Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, которые более интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Из сухих красителей, продающихся в виде порошков, готовят на­сыщенные спиртовые растворы, а из них — водно-спирто­вые, которые и служат для окрашивания микробных кле­ток. Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим — 5—7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе. Ес­ли мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены.

Сложные методы окраски применяют для изуче­ния структуры клетки и дифференциации микроорганиз­мов. Окрашенные мазки микроскопируют в иммерсион­ной системе. Последовательно нанести на препа­рат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др.

Существуют несколько основных окрасок: по Граму, по Цилю-Нельсону, по Ауески, Нейссера, Бури-Гинса.

Грам-положительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, Грам-отрицательные – в красный

Окраска по Цилю-Нильсену.

Окаска спор. Зрелая спора с трудом поддается окрашиванию из-за низкой проницаемости стенки. При окраске по Граму спорообразующей культуры краска воспринимается только вегетативной частью микроба, а спора остается бесцветной. Проницаемость ее клетки резко увеличивается после обработки горячей соляной кислотой или при испольщовании концентрированного раствора краски в подогревом. Восприняв краску, спора при последующей обработке кислотой не обесцвечивается, в то время как вегетативные клетки немедленно отдают краску.

Метод Ожешко.

• нанести несколько капель 0,5% соляной кислоты на нефиксированный мазок и нагреть до появления паров (2-3 минуты);

• слить кислоту, промыть водой, высушить;

• зафиксировать в пламени;

• окрасить по методу Циля-Нильсена (при этом споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы – в синий). Часто для окраски спор используют только метод Циля-Нильсена.

Окраска включения волютина (по Нейссеру).

Цитоплазма клетки, имеющая кислую реакцию, принимает желтый цвет. Зерна волютина – темно-синие, почти черные.

Окраска по Романовскому-Гимзе.

Относится к сложным методам окраски и применяется чаще всего для мазков-отпечатков из органов или мазков крови после фиксации в жидком фиксаторе. Позволяет выявить ядерные элементы бактериальных клеток и зерна волютина.

Протоплазма молодых клеток окрашивается в сине-фиолетовый цвет, ядерные элементы – в краснофиолетовый.