МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.5. Определение кинетических параметров культуры по данным эксперимента роста .

1/μ, ч

1/S NH4Cl, л/г

4. Вычислить и записать найденные значения Ks культуры R. eutropha.

Вопросы:

1.Каковы основные продукционные и кинетические характеристики микробных культур?

2.Почему нахождение μmax невозможно экспериментальным путем?

3.Чем отличается характер воздействия на клетку факторов лимитирования и ингибирования роста?

Работа 2.6. Методы выделения и очистки целевого биотехнологического продукта

Цель работы: дать представление об основных методах получения целевого продукта.

Завершающая стадия биотехнологического процесса — выделение целевого продукта. Эта стадия существенно различается в зависимости от того, накапливается продукт в клетке, или он выделяется в культуральную жидкость, или же продуктом является сама клеточная масса. Наиболее сложно выделение продукта, накапливающегося в клетках. Для этого клетки необходимо отделить от культуральной жидкости, разрушить (дезинтегрировать) и далее целевой продукт очистить от массы компонентов разрушенных клеток. Выделение продукта облегчается, если он высвобождается (экскретируется) продуцентом в культуральную жидкость. Поэтому понятно стремление биотехнологов получить методами генетической инженерии промышленные штаммы микроорганизмов, экскретирующих возможно большее количество ценных продуктов.

Технология выделения и очистки в значительной степени зависит от природы целевого продукта. Так, ферменты (протеазы, целлюлазы и т. д.) выделяют путем осаждения органическими растворителями или сульфатом аммония. Имеется возможность обойтись без их полной очистки, поскольку в народном хозяйстве широко используют смешанные ферментные препараты, содержащие несколько белков, близких по физико-химическим свойствам. В то же время такие ферменты, как эндо- и экзонуклеазы, ли-

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.6. Методы выделения и очистки целевого биотехнологического продукта

газы, требуют сложной многоэтапной очистки с применением тонких методов препаративного разделения. Некоторые традиционные биотехнологические процессы вообще не включают этап отделения продукта.

Первым этапом на пути к очистке целевого продукта является разделение культуральной жидкости и биомассы — сепарация. Существуют различные методы сепарации:

1)флотация, если клетки продуцента в биореакторе из-за низкой смачиваемости накапливаются в поверхностных слоях жидкости;

2)фильтрация на пористой фильтрующей перегородке;

3)центрифугирование. Метод основан на осаждении взвешенных в жидкости частиц с применением центробежной силы. Ценртрифугирование требует более дорогостоящего оборудования, чем фильтрование. Поэтому оно оправдывает себя, если: а) суспензия фильтруется медленно; б) поставлена задача максимального освобождения культуральной жидкости от содержащихся частиц; в) необходимо наладить непрерывный процесс сепарации в условиях, когда фильтры рассчитаны только на периодическое действие. Центрифугирование и фильтрация в некоторых производственных процессах реализуются в комбинации — речь идет о фильтрационных центрифугах. Широко применяют центрифуги, где разделение жидкой и твердой фаз не связано с фильтрацией и основано лишь на центробежной силе.

Следующим этапом получения целевого продукта является разрушение

клеток. Разрушение клеток (дезинтеграцию) проводят физическим, химическим и химико-ферментативным методами. Наибольшее индустриальное значение имеет физическое разрушение: ультразвуком; с помощью вращающихся лопастей или вибраторов — метод, обычно используемый в пилотных и промышленных установках; встряхиванием со стеклянными бусами; продавливанием через узкое отверстие под высоким давлением; раздавливанием замороженной клеточной массы; растиранием в ступке; осмотическим шоком; замораживанием — оттаиванием; сжатием клеточной суспензии с последующим резким снижением давления (декомпрессия).

За дезинтеграцией клеток следует этап отделения фрагментов клеточных стенок. Используют те же методы, что и при сепарации клеток: центрифугирование или фильтрацию. Однако применяют более высокоскоростные центрифуги и фильтры с меньшим диаметром пор (часто мембранные), чем при сепарации клеток. В большинстве биотехнологических процессов клеточные стенки отбрасывают как балласт, но возможно и промышленное получение компонентов клеточных стенок как целевого продукта.

Выделение целевого продукта из культуральной жидкости или гомогената разрушенных клеток проводят путем его осаждения, экстракции

или адсорбции.

Современные методы разделения веществ включают хроматографию,

электрофорез, изотахофорез, электрофокусировку, основанные на принципах экстракции и адсорбции. Разделение веществ путем хроматографии связано с

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.6. Методы выделения и очистки целевого биотехнологического продукта

их неодинаковым распределением между двумя несмешивающимися фазами. Различают хроматографию на бумаге, пластинках, колонках. При хроматографии на бумаге или на пластинках одной из несмешивающихся фаз служит движущийся растворитель, например бутанол, а другой, неподвижной фазой – волокна бумаги или частицы покрывающего пластинку силикагеля или другого материала. При колоночной хроматографии подвижная фаза – текущий через колонку растворитель, неподвижная – заполняющий колонку адсорбент, чаще всего гранулированный гель. Разделяемая смесь вводится в контакт с подвижной и неподвижной фазами.

Колоночная хроматография допускает масштабирование – увеличение размеров и пропускной способности. Она применяется в промышленных условиях и имеет несколько разновидностей.

1. Ионообменная хроматография (рис. 2.9) – гранулы адсорбента, на-

пример карбоксиметилцеллюлозы, несут на себе заряженные группы, катионные (NH4+), анионные (SO3-2), способные к захвату ионов противоположного знака. Она применяется для выделения ионизированных соединений из жидкости, а также для очистки нейтральных соединений от примесей ионной природы. Одной из первых примененных в промышленных масштабах ионообменных колонок была колонка с естественным ионообменником цеолитом для смягчения воды, т. е. удаления из нее Са2+ и Mg2+. Ионообменные колонки с амберлитом широко применяют для отделения витамина В2.

Разделяемаясмесь

смесьсвычетом

адсорбированных

ионов

Рис. 2.9. Катионнообменная хроматография (схематизировано:изображено поверхностное электростатическое взаимодействие с частицами):а, б– две стадии процесса

2. Метод «молекулярных сит», гель-хроматография, гель-фильтрация.

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.6. Методы выделения и очистки целевого биотехнологического продукта

Хроматография, основанная на разделении веществ с различной молекулярной массой и диаметром. Частицы адсорбента захватывают и удерживают, скажем, только низкомолекулярные соединения, пропуская высокомолекулярные (рис. 2.10).

Рис. 2.10. Хроматография на основе «молекулярных сит (компоненты, размеры которых соответствуют размерам пор или входов в поры адсорбента, задерживаются на колонке):

а, б — две стадии процесса

3. Аффинная хроматография – задерживается компонент, образующий прочный комплекс с лигандом, фиксированным на частицах носителя

(рис. 2.11).

Рис. 2.11. Аффинная хроматография (в виде частиц различной формы изображены молекулы с различными химическими структурами, из которых только одна вступает в специфическое взаимодействие с частицами геля. Показано, что в выемки на частицах геля входят лишь молекулы комплементарной формы): а, б – две стадии процесса

Применяют агенты, специфически связывающие одно индивидуальное вещество. Например, фермент очищают путем связывания на колонке, несущей субстрат или специфический ингибитор.

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.6. Методы выделения и очистки целевого биотехнологического продукта

Аффинная хроматография может обеспечить полную очистку продукта из сложной многокомпонентной смеси – культуральной жидкости, экстракта клеток – в одну стадию, в то время как более традиционные методы осаждения и ионообменной хроматографии требуют многоэтапной очистки, сопряженной с большими затратами труда и времени. Определенные неудобства вызывает относительная дороговизна материалов для аффинной хроматографии, в частности, веществ, используемых в качестве лигандов. Проблемой является также быстрый выход колонки из строя при пропускании через нее смесей, компоненты которых забивают промежутки между гелевыми частицами. Поэтому в производственных условиях колонки используются в периодическом, а ненепрерывном режиме.

После пропускания через колонку порции культуральной жидкости, из которой выделяют продукт, частицы геля подвергают очистке. Методы очистки основаны на: а) использовании гелевых частиц, превышающих по плотности конгломераты веществ, закупоривающих колонку: различие в плотности позволяет очистить гель путем его избирательного осаждения или проточной промывки, уносящей только загрязняющие частицы; б) придании частицам геля магнитных свойств, что позволяет провести их очистку в градиентном магнитном поле; в) упаковке частиц геля в виде ленты, покрытой тонкоячеистой оболочкой: лента вращается и проходит попеременно через жидкость с неочищенным продуктом и через буферный раствор, в который переходят загрязняющие примеси.

Масштабирование процесса аффинной хроматографии ограничивается разрушением структуры геля и уносом его частиц током жидкости. Это, в частности, обусловлено тем, что в широких колонках для крупномасштабной очистки продуктов стенки колонки уже не служат опорой для частиц геля, увлекаемых жидкостью. Увеличение высоты колонки приводит к пропорциональному возрастанию сил, разрушающих нижние слои геля. Помимо этого, для повышения эффективности и степени разделения близких по свойствам соединений целесообразно применять мелкие частицы геля (менее 1 мкм в поперечнике), но именно такие частицы легче всего увлекаются током жидкости. В последние годы изыскивают средства укрепления гелей для крупномасштабной аффинной хроматографии. Частицы агарозы – наиболее перспективного материала для гелей– предполагают укреплять путем сшивок.

Наряду с аффинной хроматографией, называемой также аффинной адсорбцией в геле, для крупномасштабного отделения и очистки продуктов биотехнологических процессов предполагают применять аффинную преципитацию и аффинное разделение. При аффинной преципитации лиганд прикрепляют к растворимому носителю. При добавлении смеси, содержащей соответствующий белок, образуется его комплекс с лигандом, который выпадает в осадок сразу после его формирования или после дополнения раствора электролитом. Аффинное разделение основано на применении системы, содержащей два водорастворимых полимера. Один из полимеров, например полиэтиленгликоль, несет специфические лиганды. Другой полимер, например высокомолекулярный декстран, обладает сродством к остальным,