МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.7. Методы анализа содержания основных (общий азот, белок)

4. Какие отличия наблюдаются при определении общего азота в клетках бактерий, отобранных в разные фазы роста?

Работа 2.8. Методы анализа запасных (полисахара, биополимеры) клеточных макромолекул

Цель работы: освоение методов определения полисахаров (А) и био-

полимеров-полигидроксиалканоатов (Б).

(А) Определениеполисахаров. Реакция основана на взаимодействии сахаров с антроновым реактивом, который образует синевато-зеленое окрашивание со всеми растворимыми углеводами. Окрашиваемость раствора определяется концентрацией сахаров. Это позволяет при определении углеводов использовать калибровочную кривую, составленную по глюкозе для определения всех углеводов.

Метод дает возможность определять полисахара типа крахмала в небольших концентрациях и пригоден для анализа бактериальных клеток.

Материалыиоборудование:

1.Антроновый реактив (0,2 %-ный раствор антрона в концентрированной серной кислоте (200 мг в 100 см 3 H2SO4);

2.3 %-ный раствор HCl;

3.Насыщенный раствор уксуснокислого свинца;

4.Насыщенный раствор сернокислого натрия;

5.Термостойкие пробирки;

6.Мерные колбы на 100 мл;

7.Пипетки на 1, 5, 10 мл;

8.Водяная баня;

9.Фотоколориметр.

Ходработы:

1.Взвесить на аналитических весах 100 мг измельченной высушенной биомассы и поместить в пробирку.

2.Залить биомассу 20 мл 3 % соляной кислотой и гидролизовать на кипящей водяной бане в течение 3 ч.

3.После гидролиза остудить пробирки и добавить 3 мл насыще н- ного раствора уксусного кислого свинца для осаждения белков и 9 мл насыщенного раствора сернокислого натрия для осаждения свинца.

4.Перенести содержимое пробирки в мерную колбу на 100 мл, сполоснуть пробирки несколькими порциями дистиллированной воды, собрать в мерную колбу и довести объем колбы водой до метки.

5.В отдельную пробирку отфильтровать раствор через фильтр «синяя лента» и отобрать для анализа 1 мл раствора в чистую пр обирку.

6.К 1 мл от фильтрованного раствора осторожно по стенке пробирки добавить 5 мл антронового реактива (пробирки с пробой предвари-

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.8. Методы анализа запасных (полисахара, биополимеры) клеточных макромолекул

тельно поставить в стакан с холодной водой или на лед) и провести р е- акцию на кипящей водяной бане в течение 15 мин.

7. После окончания реакции пробирки остудить под струей холодной воды и провести замер оптической плотности на фотоколори метре в сантиметровой кювете при красном светофильтре против холостой пробы. Холостая проба готовится так: к 1 мл дистиллированной воды д о- бавляется 5 мл антронового реактива и кипятится вместе с пробами на водяной бане.

8. Расчет содержания общих углеводов проводится по калибровочному графику. Для построения калибровочной кривой используют глюкозу. Исходный раствор – 100 мг глюкозы на 1 л воды. Из него д е- лается серия разведений от 10 до 100 мкг глюкозы в 1 мл.

Вычисления производят по формуле

Х = a x v x 100/н,

где а – количество сахара, найденное по калибровочной кривой; ν – объем экстракта; н – навеска.

Результаты анализа оформить в виде табл. 2.6.

(Б) Определение полигидроксиалканоатов (биополимер) хромато-масс-

спектрометрией. Полигидроксиалканоаты относятся к резервным (запасным) макромолекулам и образуются прокариотами при несбалансированном росте

или в стационарной фазе роста. В отличие от матричного синтеза белков ПГА синтезируются в ходе сложного многоступенчатого биосинтетического процесса, каждую стадию которого катализируют специфические ферменты. Синтез ПГА в общих чертах сходен у различных микроорганизмов (Alcaligenes, Azotobacter, Pseudomonas). Условия, обеспечивающие изменение направления анаболизма клеток с белковой программы на синтез ПГА, определяются окислительно-восстановительным состоянием цитоплазмы, внутриклеточной концентрацией пирувата и свободного КoA. Содержание этого запасного полимера можно определить двумя методами: взвешиванием выделенного из клеток полимеры – весовой метод; и хроматографическим методом после гидролиза биомассы.

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.8. Методы анализа запасных (полисахара, биополимеры) клеточных макромолекул

Материалыиоборудование:

1.H2SO4 концентрированная;

2.Абсолютный спирт;

3.Раствор бензойной кислоты в хлороформе (0,5 мг/мл);

4.Чистый полимер;

5.Аналитические весы;

6.Колбы со шливом;

7.Обратный холодильник;

8.Водяная баня с регулирующей системой нагрева;

9.Роторный испаритель;

10.Газовый хроматограф с масс-спектрометром и капиллярной колонкой;

11.Газ-носитель гелий с чистотой 99,999 %.

Ходработы:

1.На аналитических весах взвешиваем 4–5 мг высушенной и растертой биомассы бактерий и помещаем в колбочку со шлифом. Параллельно с пробой берем навеску чистого полимера (4–5 мг) и переносим ее в другую колбу.

2.К навескам биомассы и полимера приливаем 1 мл раствора бензойной кислоты в хлороформе, 0,85 мл спирта и 0,15 мл серной кислоты.

3.Прикрепляем колбы к обратному холодильнику, открываем кран с хо-

лодной водой, который соединен с холодильником, опускаем колбы в водяную баню, нагретую до 900С. Гидролиз полимера проводим в течение 140 минут.

4.После того, как колбы остынут, снимаем их с холодильника, доливаем 0,5 мл дистиллированной воды, закрываем колбы стеклянными крышками

иоставляем в холодильнике для расслоения фаз. Нижнюю хлороформную фазу используем для анализа.

5.Метиловые эфиры жирных кислот анализируем на газовом хроматографе с масс-спектрометром (GCD Plus, Hewlett Packard, USA). Отбираем микрошприцем 1 мкл нижней фазы и через специальный порт вводим пробу

вколонку газового хроматографа. Условия хроматографирования: газноситель – гелий, скорость – 1 мл/мин; температура ввода пробы – 220 0С ; начальная температура хроматографирования – 80 0С, подъем температуры до 230 0С со скоростью 8 0С в минуту; температура интерфейса – 250 0С; колонка капиллярная НР-FFAP, длина 30 м, диаметр – 0,25 мм. Получаем хроматограмму, которую распечатываем, а результаты используем для подсчета содержания полимера.

6.Рассчитываем содержание полимера в биомассе по соотношению площадей пиков внутреннего стандарта (0,5 мг бензойной кислоты) и мономера – гидроксибутирата, вводя коэффициент пересчета. Коэффициент пересчета (К) получаем из хроматограммы чистого полимера. Обычно он колеблется от 5,85 до 6,3. Пусть А – площадь пика внутреннего стандарта, Б – площадь пика мономера полимера, составляем пропорцию:

А – 0,5 мг;

Б – В мг, тогда В = К х Б х 0,5/А мг полимера в навеске (Н).

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.8. Методы анализа запасных (полисахара, биополимеры) клеточных макромолекул

Находим содержание полимера в % к сухому веществу из пропорции: В – Х %;

Н – 100 %, тогда Х % = В х 100/Н.

Результаты оформляем в табл. 2.7.

Вопросы:

1.В каких условиях роста микроорганизмы синтезируют запасные вещества?

2.Какие основные запасные вещества содержат микроорганизмы?

3.В чем заключается принцип антронового метода?

4.К какому классу органических соединений относятся полигидроксиалканоаты?

5.Каковы основные этапы газо-хроматографического определения содержания полимера в бактериях? Перечислите их.