МОДУЛЬ 6. КЛЕТОЧНАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Цель – ознакомление с методами и возможностями новейших направ-

лений биотехнологии.

Задачи:

1.Ознакомление с методами и приемами генетической инженерии.

2.Овладение методами проведения трансформации биологического

объекта.

3.Техника регистрации проведения трансформации, детекция встроенных генов и их экспрессии.

Быстрое внедрение новейших фундаментальных достижений в практику и существенное влияние последних на уровень теоретических исследований, свойственные биотехнологии, наиболее наглядно проявляются на примере развития клеточной и генетической инженерии. Традиционно для получения более активных биологических агентов применяли селекцию и мутагенез. Традиционные методы отбора в свое время сыграли важную роль в развитии различных технологий с использованием микроорганизмов. Были отобраны штаммы пивных, винных, пекарских, уксуснокислых и других микроорганизмов. Ограничения метода селекции связаны с низкой частотой спонтанных мутаций, приводящих к изменению в геноме. Генетическое конструирование in vivo (клеточная инженерия) включает получение и выделение мутантов и использование различных способов обмена наследственной информацией живых клеток. Основой клеточной инженерии является слияние неполовых клеток (гибридизация соматических клеток) с обр а- зованием единого целого.

Современную биотехнологию характеризуют как биотехнологию на основе генетической инженерии. Различают следующие уровни генетической инженерии: 1) генную – прямое манипулирование рекомбинантными ДНК, включающими отдельные гены; 2) хромосомную – манипуляции с большими группами генов или целыми хромосомами и 3) геномную – перенос всего или большей части генетического материала от одной клетки к другой. Генетическая инженерия включает технологию рекомбинантных ДНК. Работы в области генетической инженерии включают четыре основных этапа:

1)получение нужного гена; 2) его встраивание в генетический элемент (вектор), способный к репликации; 3) введение гена, входящего в со-

став вектора, в организм-реципиент; 4) идентификация (скрининг и селекция) клеток, которые приобрели желаемый ген (гены).

С помощью методов генетической инженерии в настоящее время успешно конструируют по определенному плану новые формы микроорганизмов, способных синтезировать самые различные продукты, в том числе продукты животного и растительного происхождения. С помощью генетической инженерии успешно решена проблема получения эукариотных белков на

МОДУЛЬ 6. КЛЕТОЧНАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Нуклеотидную последовательность с липкими концами можно присоединить к вектору (предварительно обработанному той же рестриктазой), превратить в кольцевую в результате сшивания лигазами взаимно комплиментарных концов. Метод имеет существенные недостатки, так как достаточно трудно подобрать действие ферментов для строгого вычленения нужного гена. Вместе с геном захватываются «лишние» нуклеотиды или, наоборот, ферменты отрезают часть гена, превращая его в функционально неполноценный.

Химико-ферментный синтез применяют в том случае, если известна первичная структура белка или пептида, синтез которого кодирует ген. Необходимо полное знание нуклеотидной последовательности гена. Этот метод позволяет точно воссоздать нужную последовательность нуклеотидов, а также вводить в гены участки узнавания рестриктаз, регуляторных последовательностей и пр. Метод состоит из химического синтеза одноцепочечных фрагментов ДНК (олигонуклеотидов) за счет поэтапного образования эфирных связей между нуклеотидами, обычно 8–16-звенных.

Ферментный синтез гена на основе выделенной матричной РНК (мРНК) является в настоящее время наиболее распространенным методом. Сначала из клеток выделяют матричные РНК, среди которых присутствует мРНК, кодируемая геном, который требуется выделить. На выделенной из клетки мРНК, как на матрице, с помощью обратной транскриптазы (ревертазы) синтезируется нить ДНК, комплиментарная мРНК (кДНК). Полученная (кДНК) служит матрицей для синтеза второй нити ДНК с использованием ДНК-полимеразы или ревертазы. Затравкой при этом служит олигонуклеотид, комплиментарный 3’-концу мРНК; новая цепь ДНК образуется из дезоксинуклеозидтрифосфатов в присутствии ионов магния. Метод с большим успехом применен для получения в 1979 г. гена гормона роста человека (соматотропина).

Полученный тем или иным способом ген содержит информацию о структуре белка, но сам не может ее реализовать. Поэтому нужны дополнительные механизмы для управления действием гена. Перенос генетической информации в клетку реципиента осуществляется в составе вектора. Вектор – это, как правило, кольцевая молекула ДНК, способная к самостоятельной репликации. Ген вместе с вектором образует рекомбинантную ДНК.

При обычном введении в бактериальную клетку ДНК подвергается ферментативной атаке, в результате которой разрушается. Чтобы этого не происходило, используют векторные молекулы ДНК, способные при введении в клетку существовать автономно, а при делениях клетки – реплицироваться. Вектор также несет в своем составе генетический признак, необходимый для последующего распознавания и отбора трансгенных организмов. Обычно в качестве маркерных генов используют гены устойчивости к антибиотикам.

Конструирование рекомбинантных ДНК осуществляется in vitro с изолированными ДНК при помощи эндонуклеаз рестрикции, которые расщепляют вектор в одном участке, превращая его из кольцевой формы в линей-

МОДУЛЬ 6. КЛЕТОЧНАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

ную с образованием липких концов, комплиментарных концам вводимой ДНК. Комплиментарные концы вектора и вводимого гена сшиваются лигазой. Полученную рекомбинантную ДНК с помощью той же ДНК-лигазы замыкают с образованием кольцевой молекулы.

В качестве векторов используют плазмиды и вирусы. Вирусы быстро транспортируются из клетки в клетку, за короткое время способны быстро заразить весь организм. Важной проблемой при их использовании является аттеньюация – ослабление патогенности для хозяина; таким образом, не очевидно, что зараженные вирусом клетки выживут и смогут передавать потомству измененную генетическую программу. Наиболее распространенными векторами являются многокопийные плазмиды с молекулярной массой 3–10 кб. Первые плазмиды были выделены из бактерий, впоследствии их стали конструировать методами генной инженерии.

Перенос рекомбинантных ДНК осуществляется путем трансформации или конъюгации. Трансформация – это процесс изменения генетических свойств клетки в результате проникновения в нее чужеродной ДНК. К трансформации способны лишь некоторые, так называемые «компетентные», клетки (способные включать чужеродную ДНК и синтезирующие особый трансформирующий белок). Компетентность клетки определяется также факторами внешней среды. Этому может способствовать обработка клеток полиэтиленгликолем или хлоридом кальция. После проникновения в клетку одна из нитей рекомбинантной ДНК деградирует, а другая за счет рекомбинации с гомологичным участком реципиентной ДНК может включиться в хромосому или внехромосомную единицу. Трансформация является наиболее универсальным способом передачи генетической информации и имеет наибольшее значение для генетических технологий.

После переноса сконструированных ДНК, как правило, лишь небольшая часть реципиентных клеток приобретает необходимый ген. Поэтому очень важным этапом является идентификация клеток, несущих ген-мишень. На первой стадии идентифицируют и отбирают клетки, несущие вектор, на основе которого осуществлен перенос ДНК. Отбор проводят по генетическим маркерам, которыми помечен вектор. Главным образом маркерами являются гены устойчивости к антибиотикам. Поэтому отбор проводят высевом клеток на среды, содержащие конкретный антибиотик. После высева на этих средах вырастают только клетки, в составе которых находится вектор с генами антибиотиковой устойчивости. На второй стадии отбирают клетки, несущие вектор и ген-мишень. Для этого используют две группы методов:

1)основанные на непосредственном анализе ДНК клеток-реципиентов и

2)основанные на идентификации признака, кодируемого геном-мишенью. При использовании первой группы методов из клеток, предположительно содержащих нужный ген, выделяют векторную ДНК, и в ней проводится поиск участков, несущих данный ген. Далее проводят секвенирование части нуклеотидной последовательности гена. Возможен другой метод – гибридизация выделенной из клеток ДНК с зондом (искомый ген или соответствующая ему мРНК); выделенную ДНК переводят в одноцепочечное состояние и вводят ее

МОДУЛЬ 6. КЛЕТОЧНАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

во взаимодействие с зондом. Далее определяют наличие двуцепочечных гибридных молекул ДНК. Во втором варианте возможен непосредственный отбор клеток, синтезирующих белок – продукт транскрипции и трансляции ге- на-мишени. Применяются также селективные среды, поддерживающие рост только клеток, приобретших ген-мишень.

Работа 6.1. Трансформация клеток E. coli xli-Blue плазмидойpGLO

Цель работы: дать представление о процедуре генетической трансформации. Провести эксперимент по трансформации клеток E. сoli, продемонстрировать связи ДНК→РНК→БЕЛОК→СВОЙСТВО организма

В рамках данной работы бактериальные клетки E. coli (XL1-Blue) трансформируют плазмидой с геном, кодирующим зеленый флюоресцентный белок (GFP, green fluorescent protein), выделенным из биолюминесцирующей медузы Aequorea victoria. Трансформированные бактериальные клетки, экспрессирующие ген GFP, продуцируют зеленый флюоресцентный белок и флюоресцируют зеленым цветом при облучении ультрафиолетовой лампой.

Бактериальные клетки помимо одной большой хромосомальной ДНК часто содержат одну или несколько небольших циклических ДНК, называемых плазмидами. В последних есть дополнительные к хромосомальным гены, экспрессия которых обеспечивает клетке дополнительные свойства. В данной работе клетки трансформируются плазмидой pGLO, в состав которой входят ген, кодирующий зеленый флюоресцентный белок (GFP); ген, кодирующий белокβ -лактамазу (bla), этот белок обеспечивает клетке устойчивость к антибиотику – ампициллину; участок специальной генетической регуляции арабинозный оперон (araC), позволяющей контролировать экспрессию флюоресцентного белка в трансформированных клетках.

Материалыиоборудование:

1.Компетентные клетки E. coli (XL1-Blue);

2.Раствор плазмидной ДНК (pGLO);

3.Трансформационный буфер;

4.Агар на LB-среде;

5.Ампициллин, р-р 200 мг/мл;

6.Арабиноза, 20 % раствор;

7.Чашки Петри;

8.Пипетки, стерильные типсы;

9.Пластиковые пробирки Eppendorf;

10.Стеклянные петли;

11.Центрифуга;

МОДУЛЬ 6. КЛЕТОЧНАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Работа 6.1. Трансформация клеток E. coli xli-Blue плазмидой pGLO

12.Контейнер со льдом, водяная баня (42 оС), термостат (37 оС);

13.Микробиологический бокс;

14.UV-лампа.

Ходработы:

1.Подписать две пластиковые пробирки +ДНК и –ДНК.

2.В боксе стерильно отобрать по 100 мкл суспензии компетентных клеток в трансформационном буфере в каждую пробирку. Поместить пробирки в ледяную баню.

3.В пробирку +ДНК внести 1 мкл раствора плазмидной ДНК. В пробирку –ДНК внести такое же количество буфера без ДНК. Выдержать обе смеси на льду не менее 20 мин.

4.Чашки Петри подписать на дне следующим образом: LB-ДНК,

LB/аmp-ДНК, LB/аmp+ДНК, LB/amp/ara-ДНК, LB/amp/ara+ДНК.

5.Расплавить агар в микроволновой печи, перенести его в бокс.

6.На дно соответствующих чашек поместить растворы ампициллина (0,25 мл, конечная конц. 200 мкг/мл и арабинозы (0,25 мл, конечная конц. 0,2 %). Залить в чашки агар (по 25 мл), осторожно перемешать и оставить полимеризоваться в боксе под UV-облучением.

7.Провести процедуру теплового шока. Для этого обе пробирки поместить в водяную баню (42 оС) на 25 сек (строго!), после чего быстро перенести их опять на лед. Выдержать 2-3 мин.

8.Пробирки вынуть изо льда, добавить по 500 мкл свежей LB-среды (стерильно!) и инкубировать при 37 оС в течение 30 мин.

9.Высеять полученные клетки на соответствующие чашки с агаром. Для этого отобрать по 100 мкл клеточной суспензии и перенести ее на по-

верхность агара. Растереть стерильной стеклянной петлей досуха, закрыть чашки, перевернуть и поместить в термостат (37 оС) на ночь.

Анализполученныхрезультатов:

1. Пронаблюдайте полученные результаты посева на чашках Петри при нормальном освещении и при облучении чашек ультрафиолетовой лампой. Внесите свои наблюдения в табл. 6.1, отвечая на следующие вопросы:

-как много колоний выросло на чашке (сравнительно)?

-какого они цвета?

-что наблюдали при облучении чашек ультрафиолетом?

Таблица 6.1

+DNA,

LB/amp

+DNA,

LB/amp/ara

-DNA,

LB/amp