МОДУЛЬ 3. ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ

Работа 3.1. Выделение ферментов (на примере светящихся белков)

4.Повторить процедуру 3, используя для промывки осадка последовательно растворы в) и г).

5.Полученный осадок ресуспендировать в том же объеме раствора д) и оставить при перемешивании на ночь при 4 оС.

Вопросы:

1.Проанализируйте выделение природного и рекомбинантного обелинов на основании предложенных результатов (таблицы по результатам выделения и данные гель-электрофореза прилагаются отдельно).

2.Какие методы используют для разрушения бактериальных клеток?

3.Что такое “тельца-включения”? Какие преимущества и недостатки они имеют при выделении рекомбинантных белков?

4.Для чего промывают тельца-включения каждым из растворов а)-г)?

5.Как переводят белки из телец-включений в раствор?

6.Сравните составы полученных фракций по данным (прилагаются отдельно) гель электрофореза. Почему апообелин выделяется из осадка телецвключений, а GFP из супернатанта?

7.Как предлагается проводить одностадийное выделение и очистку рекомбинантных белков металл-хелатной хроматографией по данным руко-

водств фирм Clontech и Qiagen?

Работа 3.2. Методы детекции ферментативной активности

Цель работы: знакомство с методами детекции ферментативной активности; спектрофотометрическое определение активности щелочной фосфатазы; определение биолюминесцентной активности Са2+ – активируемого фотопротеина обелина.

Для того чтобы успешно проводить работы с ферментами и, в частности, их выделение и очистку, необходимо уметь эффективно (быстро, просто и наглядно) определять их специфическую активность или скорость ферментативной реакции. Её определяют как количество превращенного субстрата или количество образовавшегося продукта в единицу времени. Скорость реакции следует определять в начальный промежуток времени и следить за поддержанием температуры, значения рН, избытка субстратов и кофакторов в реакционной смеси. Все эти правила и закономерности изучались студентами в курсе биологической химии. Чтобы убедиться в том, что измеренная активность ферментного препарата определяется только его концентрацией, его содержание увеличивают или уменьшают в два раза. Если при этом активность также меняется в два раза, это означает, что в данных условиях активность фермента определяется только его содержанием.

Методы детекции ферментативной активности связаны с природой реакции, которую данный фермент катализирует. Когда в процессе ферментативной реакции образуются или поглощаются газообразные продукты, для

МОДУЛЬ 3. ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ

Работа 3.2. Методы детекции ферментативной активности

измерения активности используют манометрические методы с использованием аппарата Варбурга. Примером таких реакций являются реакции окисления (поглощение кислорода), декарбоксилирования (выделение CO2) и т.д. Когда в процессе реакции образуются кислые продукты, ее скорость можно определить титрованием: количество образующейся кислоты определяют по количеству щелочи, пошедшему на ее нейтрализацию. Особое место занимают спектрофотометрические методы детекции ферментативной активности. Они применимы, когда в результате ферментативной реакции происходит образование продукта или расход субстрата, которые поглощают свет определенной длины волны, как в видимом, так и в ультрафиолетовом диапазоне спектра. Эти методы имеют ряд преимуществ – не требуют много времени для проведения анализа, обладают высокой чувствительностью, позволяют использовать для измерений малые количества образца и проводить непрерывное наблюдение за ходом реакции. Они получили широкое применение при изучении окислительных ферментов, в реакции которых задействованы никотинамидные коферменты (НАД или НАДФ). В восстановленном состоянии они имеют полосу поглощения при 340 нм, в окисленном этой полосы нет. Таким образом, по скорости уменьшения (или увеличения) интенсивности этого поглощения определяют скорость ферментативной реакции.

Спектрофотометрию можно использовать не только когда непосредственно изучаемая реакция сопровождается изменением оптической плотности. Часто не обладающие оптическим поглощением продукты являются субстратами для сопряженных ферментативных реакций, конечный продукт которых имеет характерное поглощение на определенной длине волны. Таким образом, активность исследуемого фермента определяется опосредованно – по продукту реакции сопряженного фермента. Сопряженные ферменты, естественно, не должны лимитировать скорость реакции исследуемого фермента. Очень просто определять активность ферментов, одним из продуктов реакции которых является квант света. Это так называемые биолюминесцентные и хемилюминесцентные реакции. Для измерения генерируемого светового потока используют фотометры.

Есть ферменты, определение активности которых можно проводить разными методами. Например, пероксидаза хрена катализирует реакцию пероксидазного окисления разлиных субстратов. Продукты окисления обладают поглощением в видимой области, причем в зависимости от строения молекулы продукта они поглощают в разных областях спектра (например, окисленный о-фенилендиамин – при 490 нм, 5-аминосалициловая кислота – при 450 нм и т.д.). Известны и используются субстраты пероксидазы, в результате окисления которых образуется квант света. В этом случае имеет место принципиально другой – хемилюминесцентный сигнал – и активность фермента определяют по уровню генерируемого светового потока.

В рамках данной работы предлагается провести: А) спектрофотометрическое определение активности щелочной фосфатазы и Б) определение биолюминесцентной активности Са2+ – активируемого фотопротеина обелина.

МОДУЛЬ 3. ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ

Работа 3.2. Методы детекции ферментативной активности

Щелочная фосфатаза – это фермент, катализирующий гидролиз сложноэфирной связи в фосфомоноэфирах. Одним из его субстратов является п- нитрофенилфосфат, который гидролизуется по схеме.

п-нитрофенилфосфат п-нитрофенол

Раствор п-нитрофенилфосфата не имеет окраски, а получаемый при гидролизе п-нитрофенол поглощает свет в видимой области спектра (400–420 нм). Это позволяет определять кинетические параметры реакции спектрофотометрическим методом.

Са2+ – активируемый фотопротеин обелин представляет собой устойчивый фермент-субстратный комплекс из апобелка и субстрата– пероксицелентеразина. В присутствии ионов кальция практическимгновенно развивается реакция декарбоксилирования, одним из продуктов которой является квант света.

А) Материалыиоборудование:

1.Два раствора щелочной фосфатазы (в 0,05 М глициновом буфере рН 10, содержащем 5х10-4 М MgSO4) с разной концентрацией. (Хранить в ванночке со льдом);

2.0,005 М раствор п-нитрофенилфосфата в 0,05 М глициновом буфере

срН 10, содержащем 5х10-4 М MgSO4 (раствор «А»);

3.0,02 М раствор NaOH;

4.Термостат;

5.Секундомер;

6.Спектрофотометр и кварцевые кюветы;

7.Стеклянные пробирки;

8.Набор автоматических пипеток и наконечники к ним;

9.Ванночка со льдом для хранения фермента.

Ходработы:

1.В пробирку внести 4,5 мл раствора «А» и поместить ее в термостат (30 оС) на 5–10 мин (реакционная смесь). Приготовить 4 пробирки с 9 мл 0,02

Мраствора NaOH. Пометить пробирки надписями – 2, 5, 10, 15 мин.

2.В реакционную смесь внести 0,5 мл раствора фермента, одновремен-

МОДУЛЬ 3. ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ

Работа 3.2. Методы детекции ферментативной активности

3.Через 2, 5, 10, 15 мин из реакционной смеси отбирать аликвоты по 1

мл и вносить их в пробирки со щелочью с соответствующей маркировкой. Тщательно перемешать эти растворы. Замерить оптическую плотность (D400) полученных щелочных растворов с помощью спектрофотометра в кюветах с толщиной слоя 1 см. Измерения проводить против контрольного раствора (содержит все компоненты реакционной смеси без фермента, т.е. 0,5 мл рас-

твора «А» и 4,5 мл 0,02 М NaOH).

4.Построить график изменения оптической плотности от времени и определить скорость ее изменения в начальный момент времени.

Скорость реакции V подсчитать по формуле, учитывая коэффициент

молярной экстинкции п-нитрофенола при 400 нм, равный 15,2 103:

D400 /t ,

V =10 1 1

15210,3

где 10 – коэффициент разбавления реакционной смеси раствором щелочи при остановке реакции.

Б) Материалыиоборудование:

1.Два раствора фотопротеина обелина разной концентрации;

2.Раствор для измерения активности обелина (50 мМ Трис HCl pH 8,8, 10 мМ ЭДТА);

3.Раствор CaCl2 (100 мМ, в 50 мМ Трис HCl pH 8,8);

4.Биолюминометр и кюветы для измерений к нему;

5.Самописец для регистрации сигнала;

6.Пластиковые пробирки Эппендорф (1,5 мл);

7.Набор автоматических пипеток и наконечники к ним.

Ходработы:

1.Поместить в кювету для измерений 500 мкл раствора для измерений.

2.Внести 5 мкл раствора обелина и поместить кювету в люминометр, закрыть кюветный блок.

3.Внести в кювету 250 мкл раствора CaCl2 коротким впрыском.

4.Определить величину сигнала, учитывая настройки люминометра и самописца.

5.Определить концентрацию фотопротеина в предложенных растворах (в мг/мл), используя следующие данные: 1мВ = 107 кванта/сек; удельная активность 1 мг обелина = 6,6 х 1015 кванта/сек.

Примечание. Если при измерении активности наблюдается зашкалива-

ние прибора даже при самой грубой чувствительности, рекомендуется развести белок раствором для измерений и затем учесть это разведение при проведении расчетов.