МОДУЛЬ 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «БИОТЕХНОЛОГИЯ

Работа 1.3. Фазы роста микробиологических культур и расчет кинетических параметров

3.Маточные стерильные растворы микроэлементов, железа лимоннокислого, сульфата магния и хлористого аммония;

4.Шпатели, спиртовка, мерная посуда, пипетки, колбы для выращивания бактерий, резиновые пробки с микробиологическими фильтрами;

5.Термостатируемая качалка.

Ходработы:

1.Разделиться на 4 группы по числу заданных значений концентрации хлористого аммония в среде (0,2; 0,4; 0,6 и 1,2 кг/м3) и концентрации фрукто-

зы (1; 2; 4; 8 кг/м3).

2.Каждой группе приготовить варианты питательной среды для бактерий с заданным значением концентраций фруктозы и азота:

–в микробиологическом боксе к 0,5 л среды в стерильных условиях над спиртовкой добавить 2,5 мл стандартного раствора железа, 1,5 мл раствора микроэлементов, 2 мл раствора сульфата магния и требуемый объем раствора хлорида аммония (в 1 мл которого содержится 100 мг соли);

–около 200 мл среды отбросить;

–оставшиеся 300 мл среды засеять инокулятом, смыв культуру с одного музейного “косяка”(использовать шпатели);

–инокулят разлить в ферментационные колбы объемом 100 мл;

–колбы плотно закрыть пробками;

–колбы подписать согласно номеру эксперимента;

–на ФЭК измерить оптическую плотность (без разведения) каждого инокулята;

–колбы установить на качалку.

3.По истечении 15 часов культивирования через каждые 30 мин (осуществить четыре повторности) провести измерения оптической плотности культуры и по калибровочной кривой определить концентрацию биомассы в

культуре, а затем рассчитать удельную скорость роста µ, ч-1.

4.Данные представить в виде графической зависимости (рис.1.2).

5.Построить зависимости 1/ µ = f (1/S1) и 1/ µ= f (1/S2) и определить вид механизма и константы, входящие в уравнения (3) или (4).

6.Оформить работу и сделать выводы.

Вопросы:

1.Какими методами определяют удельную скорость роста микроорга-

низмов?

2.Периодическое и непрерывное культивирование.

3.Модели роста культуры.

Работа 1.3. Фазы роста микробиологических культур и расчет кинетических параметров

Цель работы: знакомство с циклом развития микробных культур и спецификой фаз периодической культуры.

МОДУЛЬ 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «БИОТЕХНОЛОГИЯ

Работа 1.3. Фазы роста микробиологических культур и расчет кинетических параметров

Впростой гомогенной периодической культуре все ее части находятся

водинаковых условиях. Различные фазы роста такой культуры (рис. 1.5) отражают изменения в биомассе и в окружающей среде.

Периодическая культура начинается с лаг-фазы, которая является совершенно необязательной фазой роста. Ее возникновение зависит от несоблюдения оптимальных условий для роста посевного материала. Происходит перепад концентраций элементов питания, особенно углеродного, от сниженных – в выросшей культуре, из которой берется посевной материал, к высоким – в свежей среде.

Рис 1.5. Фазы на кривой роста периодической культуры: I – лаг-фаза; II – фаза ускорения роста; III – фаза экспоненциального роста;

IV – фаза замедления роста; V – стационарная фаза; VI – фаза отмирания

Истощенные клетки старого посевного материала должны перейти из состояния голодания или отравления в состояние, соответствующее способности к размножению, которое определяется необходимым количеством и состоянием рибосом, способностью и условиями к репликации хромосом, синтезу клеточной стенки и т. п.

Далее следует экспоненциальная фаза, в наибольшей степени характеризующая и выражающая способность культуры к размножению. В этой фазе сведены к минимуму все лимитирующие и ингибирующие влияния. Компоненты питательной среды имеются в избытке, продукты обмена еще не накопились. Рост идет с максимально возможной скоростью, генетически заложенной в клетке. Если же среда по своему начальному составу не оптимальна, то рост будет ограничен неподходящим питанием или неоптимальным значением рН и т. п. В этом случае рост может быть описан более пологой экспонентой или прямой.

Эта фаза в лабораторных условиях не может быть длительной, так как даже не очень плотная популяция вскоре начнёт испытывать недостаток в кислороде из-за его быстрого поглощения и слабой растворимости.

МОДУЛЬ 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «БИОТЕХНОЛОГИЯ

Работа 1.3. Фазы роста микробиологических культур и расчет кинетических параметров

Фаза замедления роста может быть очень разнообразной и самой сложной. Она может полностью отсутствовать на простых синтетических средах, когда рост сразу останавливается из-за отсутствия одного элемента питания, в особенности – источника углерода и энергии. Рост клеток прекращается, и наступает стационарная фаза, в данном случае – фаза голодания по использованному элементу питания. На сложных средах, содержащих несколько источников углерода, может происходить поочередная их утилизация и постепенное замедление роста. При избытке питания рост замедляется из-за накопления продуктов метаболизма. Токсичные продукты метаболизма у микроорганизмов весьма разнообразны. Возможно одновременное отравление и голодание. В соответствии с этим и стационарная фаза может содержать самые разнокачественные клетки: живые, но голодающие, живые, но ингибированные, отмирающие по причине голодания или отравления. Стационарная фаза не характеризует культуру, так как в этот период состояние клеток может быть самым разнообразным. Только экспоненциальная фаза до некоторой степени характеризует свойства культуры.

Таким образом, клетки периодической культуры претерпевают значительные изменения всех свойств по всему периоду роста, обусловленные непрерывными изменениями окружающей среда и быстрой реакцией на них клеток. Тем не менее периодические методы культивирования микроорганизмов широко используются в настоящее время в промышленной биотехнологии и исследовательской практике. Техника периодической культуры позволяет получить исходные данные, и расходные коэффициенты, и кинетические характеристики культуры, необходимые для перехода к проточным системам и масштабированию процесса.

Материалыиоборудование:

1.Музейная культура штамма R. eutrophus B-5786;

2.Стерильный раствор базового фосфатного буфера для среды;

3.Маточные стерильные растворы микроэлементов, железа лимоннокислого, сульфата магния и хлористого аммония;

4.Шпатели, спиртовка, мерная посуда, пипетки, колбы для выращивания бактерий, резиновые пробки с микробиологическими фильтрами;

5.Термостатируемая качалка.

Ходработы:

1.Приготовить питательную среду для выращивания бактерий:

–в микробиологическом боксе к 0,5 л основной среды (фосфатный буфер) в стерильных условиях над спиртовкой добавить 2,5 мл стандартного раствора железа, 1,5 мл раствора микроэлементов, 2 мл раствора сульфата магния и требуемый объем раствора хлорида аммония (в 1 мл которого содержится 100 мг соли); углеродный субстрат ( из расчета 10 г/л фруктозы);

–инокулят разлить в 10 ферментационных колб по 100 мл (10 колб для периодической культуры), используя стерильную мерную посуду;

МОДУЛЬ 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «БИОТЕХНОЛОГИЯ

Работа 1.3. Фазы роста микробиологических культур и расчет кинетических параметров

–колбы плотно закрыть ватно-марлевыми пробками;

–колбы подписать (например, 1а, 1б, 1в и т. д.);

–измерить исходную оптическую плотность культуры. 2. Колбы установить на качалку.

3. Периодически производить отбор проб для измерения оптической

плотности культуры на ФЭК и микроскопирования клеток. В колбы, предназначенные для подпитки, через 12, 24 и 36 ч после начала культивирования внести дополнительный субстрат (раствор фруктозы из расчета 10 г/л).

4. Данные занести в табл. 1.4.

Таблица 1.4

Показатели роста культуры R.eutropha в ходе развития периодической культуры

5. По результатам эксперимента построить кривые роста культур (по накопления биомассы в культуре) бактерий.

Вопросы:

1.Какие исследования позволяет проводить техника периодического культивирования микроорганизмов?

2.В чем «узкие» места периодической культуры?

3.Каковы отличия и преимущества периодического режима культивирования микроорганизмов с подпиткой субстратом, тубулярной культуры и непрерывных культур?