МОДУЛЬ 3. ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ

Работа 3.1. Выделение ферментов (на примере светящихся белков)

Цельработы: знакомство с методами выделения и очистки ферментов из различных источников; выделение рекомбинантных апообелина и зеленого флюоренцентного белка (GFP) из биомассы E.сoli.

Процедура получения препаратов различных ферментов включает в себя две основных стадии – выделение и очистку. Под выделением подразумевают получение обогащенного экстракта целевого белка из клеток (бактериальных, растительных или животных). Как правило, эти экстракты содержат достаточно много различных примесей. Для получения препарата фермента высокой чистоты производят дополнительную очистку с использованием различных, в основном хроматографических, методов. На стадии выделения проводят разрушение клеточной стенки, и методы, которые для этого применяют, естественно, зависят от природы клеток, а также локализации целевого фермента в клетке. Так, животные и растительные клетки чаще всего разрушают механически гомогенизаторами с металлическими ножами. Бактериальные клетки разрушают механически (на специальной установке – френчпрессе – клеточная паста продавливается под высоким давлением через микронную щель, образованную стальными лезвиями), с помощью ультразвуковой обработки, процедурой замораживания – оттаивания, ферментативной обработкой (например, лизоцимом). Для разрушения дрожжевых клеток эффективнее всего использовать кратковременную тепловую обработку в щелочных условиях.

Экстракцию белков из полученного гомогената проводят водой, но чаще всего – буферными растворами, содержащими необходимые добавки и имеющими значения рН, которые обеспечивают максимальную стабильность целевого белка. Полученный экстракт наряду с интересующим ферментом всегда содержит ряд примесей белковой и небелковой природы. Чтобы избавиться от балластных примесей, используют различные способы фракционирования, выбор которых зависит от свойств целевого белка. Например, если фермент термостабилен, даже слабая термообработка позволит избавиться от всех термолабильных белков в смеси; если фермент устойчив в кислой среде

– подкисление раствора поможет избавиться от балластных белков, денатурирующих при этих условиях и т. д.

Очень часто для обогащения экстракта целевым ферментом используют такие приемы, как солевое осаждение, осаждение органическими растворителями, избирательную абсорбцию. Следует заметить, что изменения параметров среды производят очень постепенно, не используя сильных кислот и щелочей. Все процедуры проводят на холоде.

Результаты очистки рекомендуется суммировать в табл. 3.1.

МОДУЛЬ 3. ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ

Работа 3.1. Выделение ферментов (на примере светящихся белков)

Процедура выделения целевых ферментов существенно упрощается, когда речь идет о получении рекомбинантных белков. Используемые в настоящее время экспрессирующие системы на базе бактериальных клеток E.coli позволяют получать большие количества целевого белка – иногда его содержание достигает более 50 % от всех клеточных белков. При такой высокой экспрессии рекомбинантных белков, как правило, клетки-хозяева «пакуют» их в виде нерастворимых частиц, так называемых «телец-включений». Выделение белков из телец-включений имеет ряд преимуществ: а) в них рекомбинантный белок находится практически в чистом виде; б) находясь в нерастворенном виде, он практически не подвергается протеолизу; в) после разрушения клеток целевой белок отделяется от остального клеточного содержимого простым центрифугированием. Из телец-включений рекомбинантные белки переводят в раствор с помощью высоких концентраций хаотропных агентов – мочевины или гуанидин-хлорида и при необходимости дополнительно очищают. Однако следует иметь в виду, что при выделении белка из телец-включений часто возникают проблемы его посттрансляционного фолдинга (т. е. формирования правильной, функционально активной третичной структуры). Дело в том, что молекулы белка в тельцахвключениях не обладают определенной третичной структурой и специфической активностью. Особенно остро эта проблема может возникнуть, например, когда целевой белок должен образовывать правильные S-S мосты.

При экспрессии рекомбинантного белка в цитоплазму современная биотехнология предлагает системы, позволяющие проводить и выделение, и очистку белка в одну стадию. Для этого конструируют плазмиды, в которых рядом с геном целевого белка находится последовательность, кодирующая дополнительный признак. Получаемые при этом химерные белки за счет этого признака обладают аффинностью к определенным белкам или гаптенам, иммобилизованным на твердом инертном носителе. Грубый необогащенный клеточный экстракт пропускают через такой носитель, и из всей смеси на нем сорбируется только целевой рекомбинантный белок. После промывок его элюируют в специальных условиях в практически индивидуальном состоянии.

Ярким примером такой системы является так называемая металлхелатная хроматография. В ее основе лежит способность ионов двухвалентных переходных металлов (Ni2+, Co2+, Zn2+ и др.) образовывать комплексные соединения, в частности с молекулами имидазола. Белки, обогащенные гистидиновыми остатками, обладают повышенным сродством (аффинностью) к сорбентам, на поверхности которых иммобилизованы ионы этих металлов

МОДУЛЬ 3. ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ

Работа 3.1. Выделение ферментов (на примере светящихся белков)

(металл-активированная матрица). Это обогащение можно произвести искусственно, закодировав полигистидиновые фрагменты на С- или N-концах молекулы целевого белка. (Какие кодоны кодируют гистидин?). При контакте с металл-активированной матрицей из всех белков клеточного лизата на ней абсорбируются только рекомбинантный белок с искусственным поли-His фрагментом. Для элюции этого белка используют либо растворы имидазола, либо растворы с пониженным значением рН (4–5). Если необходимо избавиться от поли-His фрагмента, в генетическую конструкцию между геном белка и геном этого фрагмента «вшивают» участки, кодирующие специфические протеазные сайты. После инкубации раствора целевого белка с соответствующей протеазой отщепленный фрагмент отделяют повторным пропусканием полученной смеси через металл-активированную матрицу.

Широко известны и используются в нашей лаборатории для выделения рекомбинантных светящихся белков подобные системы фирм Clontech

иQiagen.

Врамках данной работы предлагается провести выделение двух рекомбинантных белков – апообелина и зеленого флуоресцентного белка (GFP).

Материалыиоборудование:

1.Биомасса двух видов трансформированных клеток E. coli;

2.Буферные растворы для промывки телец-включений:

а) 20 мМ раствор Трис-HCl, рН 7,0 – 100 мл; б) 0,9 % раствор NaCl в а) –20 мл;

в) 0,1 % раствор Triton X-100 в а) –20 мл;

г) 5 мМ раствор CaCl2 в а) –20 мл;

д) 6М мочевина, 20 мМ Трис-HCl, рН 7,0, 5 мМ CaCl2 – 20 мл;

(Все перечисленные растворы студенты готовят из соответствующих концентрированных растворов.)

3.Ультразвуковой дезинтегратор;

4.Центрифуга и пробирки к ней;

5.Весы для уравновешивания центрифужных стаканов;

6.Набор автоматических пипеток и наконечники к ним.

Ходработы:

1.Ресуспендировать клетки в пятикратном объеме 20 мМ раствора Трис-HCl, рН 7,0 (вес/объем) и разрушить с помощью УЗ-дезинтегратора (5х20 сек при охлаждении льдом).

2.Полученную смесь центрифугировать (4-5 тыс. об./мин, 20 мин). Опишите, как выглядят полученные вами супернатанты и осадки.

3.Супернатант отделить, а осадок ресуспендировать в таком же объеме раствора б) и вновь отцентрифугировать.