МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.3. Проточные культуры: хемостат, турбидостат

9. При достижении температуры культуры 30 0С начнется рост культу-

ры;

10.Периодически (через 30 мин) отбирать пробы для определения оптической плотности культуры. При оптической плотности культуры 0,1 (без разведения) включить насос-дозатор на минимальную скорость протока

(0,1 ч-1);

11.Ежечасно определять ОП культуры;

12.При увеличении ОП постепенно увеличивать скорость протока среды до состояния steady-state ( величина Х, г/л – постоянна);

13.Вычислить значение удельной скорости роста культуры, определить время достижения состояния steady-state, получить культуру (хранить в холодильнике) для последующих занятий.

Вопросы:

1.Вчемпринципиальное отличие проточной культуры от периодической?

2.Каковы основныетребованиякорганизации проточной ферментации?

3.Каковы преимущества проточной культуры?

4.Что позволяет техника проточных культур?

Работа2.4. Проведение процесса ферментации слимитированием субстрата

Цель: освоение техники ведения процесса выращивания микроорганизмов с лимитированием субстрата для нахождения условий роста, влияющих на биохимическую программу синтеза макромолекул.

Процессы микробного синтеза делятся на два типа: 1). процессы, связанные с ростом биомассы и происходящие параллельно со скоростью размножения клеток, и 2). процессы, происходящие или ускоряющиеся при замедлении скорости роста клеток. Оптимизация обоих типов процессов осуществляется различными путями в зависимости от того, насколько совпадают (или не совпадают) оптимизация скорости роста со скоростью синтеза макромолекул той или иной природы.

Процесс роста – это процесс синтеза первичных метаболитов (аминокислот, органических кислот, витаминов, нуклеотидов, промежуточных продуктов катаболизма) и их сборка в основные клеточные макромолекулы (белки, нуклеиновые кислоты, полимеры, образующие клеточную стенку). Рост и синтез этих продуктов максимален, когда клетка максимально обеспечена субстратом. В периодической культуре это имеет место в экспоненциальной – начале линейной фазы роста. Таким образом, оптимизация процесса накопления максимальной биомассы клеток в культуре и синтеза первичных продуктов обмена сводится к оптимизации условий питания и созданию условий сбалансированного роста для культуры. Накопление продуктов обмена, происходящих во второй фазе развития культуры (конец линейной – ста-

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.4. Проведение процесса ферментации с лимитированием субстрата

ционарная фаза), – запасных соединений (полифосфатов, полисахаров, липидов) или вторичных продуктов обмена (антибиотиков, терпенов, стероидов), имеет для микробной технологии большое значение. Накопление запасных соединений в клетках имеет место при несбалансированном росте вследствие исчерпания из среды какого-либо биогена и лимитирования процесса синтеза основных макромолекул. Синтез вторичных продуктов обмена (идиолитов) имеет место в случае замедления и остановки роста клеток в конце развития популяции (конец стационарной фазы – фаза отмирания), когда происходит дерепрессия ферментов, катализирующих реакции образования данных соединений и репрессированных на стадии сбалансированного роста. Оптимизация процесса синтеза запасных соединений и вторичных метаболитов более сложна, так как требует специальных знаний о закономерностях образования тех или иных макромолекул и специфических подходов в каждом конкретном случае.

При лимитации роста микроорганизмов отдельными элементами минерального питания происходит замедление скорости роста клеток, сопровождающееся значительными изменениями химического состава, главным образом, соотношения основных и запасных макромолекул. Выявление принципиальных закономерностей этих изменений открывает широкие возможности для направленного изменения составом микробной биомассы и целевого получения конкретных продуктов микробиологического синтеза. Более того, помимо изменения направленности биохимической программы синтеза основных и запасных соединений лимитация роста клеток тем или иным минеральным элементом позволяет дополнительно регулировать химическую структуру отдельных соединений, входящих в состав клеток.

Отправным моментом является изменение соотношения C/N в питательной среде. Клетки, лимитированные по азоту и не способные синтезировать основные соединения (белки и нуклеиновые кислоты), потребляя углерод, направляют его на образование различных безазотистых соединений углеводной и липидной природы. Качественный состав запасных соединений, синтезируемых при лимитации роста микроорганизмов по азоту на фоне избытка углерода (увеличение отношения C/N), определяется спецификой фи- зиолого-биохимических свойств конкретных микробных видов, а также штаммов.

Материалыиоборудование:

1.Музейная культура штамма R. eutrophus B–5786;

2.Стерильный раствор базового фосфатного буфера для среды;

3.Маточные стерильные растворы микроэлементов, железа лимоннокислого, сульфата магния и хлористого аммония;

4.Шпатели, спиртовка, мерная посуда, пипетки, колбы для выращивания бактерий, резиновые пробки с микробиологическими фильтрами;

5.Термостатируемая качалка (или шейкер-инкубатор).

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.4. Проведение процесса ферментации с лимитированием субстрата

Ходработы:

1.Приготовить 4 варианта среды с различными концентрациями хлористого аммония в среде (0,8; 0,4; 0,2 и 0,1 г/л):

–в микробиологическом боксе к 0,5 л фосфатного буфера над спиртовкой (или в боксе-ламинаре) добавить 2,5 мл стандартного раствора железа, 1,5 мл раствора микроэлементов, 2 мл раствора сульфата магния и требуемый объем раствора хлорида аммония (в 1 мл которого содержится 100 мг соли); раствор углеродного субстрата (из расчета 5 – 10 г/л фруктозы);

–около 200 мл среды отбросить;

–оставшиеся 300 мл среды засеять инокулятом, смыв культуру с одной музейной пролбикиго (использовать шпатели);

–инокулят разлить в три ферментационные колбы по 100 мл (три би о- логические повторности), используя стерильную мерную посуду;

–колбы закрыть ватно-марлевыми пробками;

–колбы подписать (например, 1а, 1б, 1в);

–на ФЭК измерить оптическую плотность (без разведения) каждого инокулята;

–колбы установить на качалку.

2.В течение 3–4 дней проводить измерения оптической плотности культуры и по калибровочной кривой – определить концентрацию биомассы

вкультуре Х, г/л.

3.Данные занести в табл. 2.3.

Таблица 2.3

Показатели роста культуры R. eutropha при различной обеспеченности азотом

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.4. Проведение процесса ферментации с лимитированием субстрата

Вопросы:

1.В чем специфика метаболизма водородокисляющих хемоавтотрофных микроорганизмов?

2.В чем основные трудности культивирования газоиспользующих микроорганизмов?

3.Что позволяет фиксировать в ходе культивирования водородных бактерий метод Шлегеля?

Работа 2.5. Определение кинетических параметров культуры по данным эксперимента роста

микроорганизмов с лимитированием субстрата

Цель работы: обучение нахождению основных характеристик микробной культуры на основе экспериментальных результатов.

Скорость роста является одним из основных показателей, характеризующих адекватность условий ферментации для микроорганизмов. Скорость роста (увеличение биомассы) организмов с бинарным делением в хорошо перемешиваемой среде в периодической культуре будет пропорциональна концентрации микробной биомассы:

где dX/dt – скорость роста, Х – биомасса, µ – коэффициент пропорциональности («удельная скорость роста»); параметр аналогичен сложным процентам (например, если удельная скорость роста равна 0,1 ч–1, значит увеличение биомассы равно 10 % в час). Если величина µ постоянна, как это бывает в установившемся режиме культивирования, то интегрирование представленного уравнения дает

lnX = lnX0 +µ t,

(2)

где Х0 – биомасса в начальный период времени t.

График зависимости lnX от времени будет иметь вид прямой линии с наклоном µ.

Валовая (или общая) скорость роста v характеризуется абсолютным приростом биомассы за единицу времени:

v=dX/dt.

(3)

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.5. Определение кинетических параметров культуры по данным эксперимента роста .

Обе величины, удельная и общая скорость роста, характеризуют данную культуру в данных условиях и не являются количественной характеристикой штамма.

Рост культуры µ характеризуется кривой зависимости плотности популяции (биомассы) Х от концентрации субстрата S, обычно имеющей широкое плато (зону независимости величины биомассы от концентрации биогена) (рис. 2.6, а). Когда скорость роста микробной культуры ограничена не дефицитом субстрата, а воздействием ингибитора, кривая зависимости величины биомассы от концентрации ингибитора имеет иной вид (рис. 2.6, б).

Рис. 2.6. Зависимость скорости роста микробной культуры от концентрации субстрата: а – зависимость µ от S (концентрации минерального субстрата); б – зависимость µ от I (концентрации ингибитора)

Продуктивностьпроцесса микробного роста характеризуется количеством продукта, получаемого на единицу объема биореактора в единицу времени. Продуктивность процесса зависит от многих факторов: активности продуцента, значений коэффициента выхода продукта из потребленного субстрата, количества активной биомассы в ферментере:

П = qs Yp/s X, г/л ч,

(4)

где qs – скорость потребления субстрата (метаболический коэффициент), Yp/s – выход продукта (экономический коэффициент), X – концентрация био-

массы, P – продукт, S – субстрат.

Выход продукта Y (экономический коэффициент) определяется как количе-

ство продукта, получаемого из данного количества субстрата:

Y = X/Sо – S,

(5)

где S и So – конечная и исходная концентрации субстрата.

Данный коэффициент выражает эффективность использования субстрата для получения целевого продукта и является очень важной характеристикой, так как непосредственно связан с продуктивностью и позволяет непосредственно влиять на себестоимость конечного продукта. Экономический

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.5. Определение кинетических параметров культуры по данным эксперимента роста .

коэффициент имеет четкий физический смысл, характеризующий степень перехода энергии, заключенной в субстрате, в продукт. Данная величина необходима для расчетов и прогнозирования процесса в целом и используется в качестве параметра для контроля и управления ходом различных процессов и сопоставления их эффективности.

Основой для изучения кинетики роста микробных культур является метод острых опытов; этим методом определяют основные показатели роста: субстратную константу Ks, константу ингибирования Ki, максимальную скорость роста µmax и влияние на них внешних факторов. Для этого клетки из экспоненциальной фазы роста помещают на короткий промежуток времени в среды с различной концентрацией исследуемого субстрата и через короткий промежуток времени t2 – t1 измеряют плотность культуры и вычисляют удельную скорость роста по уравнению (2). В контроле скорость роста не лимитирована субстратом, в экспериментальных пробах – лимитирована заданной концентрацией исследуемого субстрата. Полученные результаты обрабатываются по методу обратных величин Лайнуевера и Берка, µmax и Ks строится график зависимости 1/ и 1/S, после этого графически находятся величины (рис. 2.7).

Рис. 2.7. Схема определения µmax и Ks методом обратных величин (по Лайнуеверу и Берку): а – зависимость µ от S: б – прямая отсекает 1/µmax и 1/Ks

Аналогичным способом находят константу ингибирования (Ki), к пробам растущей культуры добавляют различные дозы ингибитора и заменяют скорость роста при различных концентрациях последнего. Далее строится

график, по которому графически определяют искомые величины: µmax и Ki

(рис. 2.8).

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.5. Определение кинетических параметров культуры по данным эксперимента роста .

Рис. 2.8. Схема определения µmax и Ki методом обратных величин (по Лайнуеверу

и Берку): а – зависимость µ от I: б – прямая отсекает 1/µmax и 1/ Ki

Материалыиоборудование:

Персональный компьютер.

Ходработы:

1. Используя известные уравнения, определить значения удельной скорости роста при заданных (четырех) концентрациях азота в среде (из результатов табл.1), а также вычислить продуктивность культуры и экономический коэффициент по азоту. Значения занести в табл. 2.4.

Таблица 2.4

Влияние концентрации NH4Cl в среде на характеристики культуры R. Еutropha

2. Построить график зависимости удельной скорости роста бактерий R.eutropha от концентрации NH4Cl в среде.

μ, 1/ч

NH4Cl, г/л

3. Используя графоаналитический метод Лайнуевера – Берка построить график зависимости обратных величин удельной скорости роста от обратной величины концентрации азота в среде.