МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.1. Типы ферментационных процессов

Материалыиоборудование:

1.Термостатируемая качалка-шейкер для культивирования микроорганизмов;

2.Лабораторный ферментационный комплекс «BioFlo”;

3.Опытное производство биополимеров.

Ходработы:

Проведение экскурсии и знакомство с типами ферментационных процессов:

-периодическим аэробным жидкофазным;

-проточным в лабораторном ферментере на гетеротрофном субстрате;

-проточном в лабораторном ферментере на газовом субстрате;

-посещение опытного производства биополимеров.

Работа 2.2. Периодическое культивирование микроорганизмов и культивирование с подпиткой субстратом

Цель работы: обучение технике культивирования микроорганизмов в режиме периодического процесса.

Культуры микроорганизмов можно подразделять на «открытые» и «закрытые» системы. Закрытой называют такую систему, в которой хотя бы один из существенных компонентов не может ни поступать в систему, ни покидать ее. Простая периодическая культура, содержащая ограниченное первоначальное количество питательного субстрата, служит примером закрытой системы. В закрытой системе скорость роста биомассы должна стремиться к нулю либо из-за недостатка субстрата, либо из-за непереносимости продукта при его дальнейшем накоплении. Такие системы всегда находятся в неустойчивом состоянии. Процесс выращивания микроорганизмов до недавнего времени представлялся довольно простым, идущим через ряд принципиально общих стадий, приводящих к получению из ничтожного количества посевного материала значительного количества биомассы или биомассы и продуктов метаболизма. Кривая роста – это суммарная запись истории роста культуры. Фазы роста не столько изучались, сколько просто описывались.

После лаг-периода наблюдается максимальная скорость роста, затем рост прекращается либо из-за недостатка источников питания, либо из-за накопления ингибирующих продуктов, либо из-за некоторых изменений в физических свойствах среды. После того как биомасса достигнет максимума, наступает стационарная фаза, в которой количество биомассы остается постоянным. Затем, раньше или позже, количество биомассы уменьшается в результате метаболических процессов, связанных с поддержанием жизнедеятельности, или автолиза. Продолжительность экспоненциального роста частично зависит от начальной концентрации субстрата, лимитирующего рост. Кажущееся замедление роста, стационарная фаза и фаза отмирания могут наступить, если возникнут некоторые условия, летальные для организ-

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.2. Периодическое культивирование микроорганизмов и культивирование с подпиткой субстратом

5.Измерить исходную оптическую плотность культуры;

6.Колбы установить на качалку;

7.В 5 колб для культивирования с подпиткой субстратом через 12, 24 и 36 ч после начала роста культуры внести добавку углеродного субстрата ( из расчета 1-2 г/л л);

8.Периодически производить отбор проб для измерения оптической плотности культуры на ФЭК и микроскопирования клеток.

9.Данные занести в табл. 2.1.

Таблица 2.1

Показатели роста культуры R. eutropha в ходе развития периодической культуры

10. По результатам эксперимента построить кривую накопления биомассы культур.

Вопросы:

1.Каковы основные требования к организации периодического культивирования микроорганизмов?

2.Какие основные характеристики микробного роста в периодической культуре?

3.Каковы отличия и преимущества периодического режима культивирования микроорганизмов с подпиткой субстратом?

Работа 2.3. Проточныекультуры: хемостат, турбидостат

Цель: дать представление о методах, инструментальном оформлении и возможностях метода проточных культур.

Метод проточного культивирования вошел в микробиологию и базируется на процессах химической технологии. Принцип проточного культивиро-

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.3. Проточные культуры: хемостат, турбидостат

вания состоит в том, что в сосуд, где размножаются микр оорганизмы, непрерывно подается свежая питательная среда и одновременно вытекает такой же объем культуры. По такому принципу организуются два различных процесса культивирования: процесс полного вытеснения и процесс полного смешения. В первом случае сосуд для выращивания представляет собой трубку, тубулярный ферментер, в которой втекают среда и посевной материал и вытекает культура. Перемешивание не производится (рис. 2.3).

Х0

Х0 + S0 + P

S0

Рис. 2.3. Схема тубулярного биореактора полного вытеснения: sr – концентрация субстрата в поступающей среде; i – то же в вытекающей среде;

s1 – то же в фе рментере; плотности: х± – подаваемой популяции, х2 – вытекающей культуры; х – популяции в ферментере

Подобным образом можно культивировать микроорганизмы, не требующие аэрации. У одного конца ферментера, куда подается среда и культура, клетки находятся в начале стадии роста; по мере прохождения клетками трубки культура "стареет", исчерпывается субстрат, накапливаются продукты метаболизма и перед вытеканием культура находится в состоянии, аналогичном стационарной фазе роста периодической культуры. Таким образом, в трубке воспроизводится полная кривая роста, ноне во времени, а в пространстве.

Непрерывные процессы. В непрерывных процессах биообъектпостоянно поддерживается в экспоненциальной фазе роста. Обеспечивается непрерывный приток свежей питательной среды в биореактор и отток из него культуральной жидкости, содержащей клетки и продукты их жизнедеятельности. Фундаментальным принципом непрерывных процессов служит равновесие между приростом биомассы за счет деления клеток и их убылью в результате разбавления свежей средой:

μ= D ,

где μ — удельная скорость роста клеток, D — коэффициент разбавления (скорость убыли концентрации клеток). Различают хемостатный и турбидостатный режимы непрерывного культивирования.

В процессе полного смешения рост происходит в емкости – ферментере при интенсивном перемешивании (рис. 2.4).

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.3. Проточные культуры: хемостат, турбидостат

A Б

Рис. 2.4. Схемы биореакторов для проточного культивирования микроорганизмов: А – хемостат; Б – турбидостат с автоматической регуляцией оптической плотности; 1 – поступление среды, 2 – мешалка, 3 – сток культуры, 4 – насос, 5 – фотоэлемент, 6 – источник света

Перемешивание достигается продуванием воздуха или работой мешалки либо тем и другим способом одновременно. Во всей массе культуры условия должны быть совершенно одинаковыми. Этот метод культивирования называется гомогенно-непрерывным или гомогеннопроточным. В ферментере создаются условия, соответствующие одной точке кривой роста. При быстром протоке среды эти у словия близки к быстрому экспоненциальному росту, при медленном – приближаются к условиям стационарной фазы. При таком методе культивирования может быть воспроизведена любая периодическая культура от начала замедления роста после экспоненциальной фазы и до конца стадии замедления роста. В установившемся режиме скорость протока среды равняе т- ся удельной скорости роста культуры. При этом культура находится в устойчивом состоянии динамического равновесия и обладает способностью подстраиваться к изменениям условий.

При хемостатном режиме культивирования в биореактор с постоянной контролируемой скоростью вливают питательную среду, один из компонентов которой, часто Ог, поступает в количестве, не достаточном для обеспечения максимальной скорости роста культуры. В этом случае реактор с биообъектом приобретает свойства саморегулирующейся системы, автоматически удовлетворяющей равенству μ= D . Если первоначально скорость разбавления и вымывания биомассы превышает скорость роста клеток, то наступает разбавление культуры свежей средой. Это ведет к повышению концентрации компонента, ограничивающего рост, вследствие чего скорость роста культуры увеличивается. Как только μ превысит D, в реакторе начинает концентрироваться биомасса. Увеличивающаяся популяция клеток все активнее «выедает» субстрат, его концентрация падает, что, в свою оч е- редь, ведет к торможению роста культуры. Таким образом, после серии затухающих колебаний скорость роста культуры становится равной скорости ее разбавления.

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.3. Проточные культуры: хемостат, турбидостат

Биореактор, работающий в хемостатном режиме культивирования, называют хемостатом. Он включает: 1) устройство для вливания питательной среды; 2) выпускное приспособление для оттока культуральной жидкости с клетками; 3) систему контроля скорости протока (рис. 2.4, А).

Один из простейших вариантов хемостата содержит насос, постоянно нагнетающий питательную среду в биореактор, и выпускную трубу, по которой жидкость из биореактора вытекает, как только ее уровень поднимается выше горловины этой трубы. Альтернативный вариант — выпускная труба входит в полость биореактора сверху и нижний обрез ее горловины соответствует уровню, выше которого жидкость не должна подниматься. Если этот уровень превышен, избыток культуральной среды с клетками отсасывается насосом, подсоединенным к выпускной трубе.

Турбидостатный режим культивирования основан на прямом контроле концентрации биомассы. Наиболее распространено измерение светорассеяния содержимого биореактора с помощью фотоэлемента. Сигнал от фотоэлемента управляет скоростью протока жидкости, в свою очередь определяющего скорость роста культуры (рис. 2.4, Б). Повышение концентрации клеток и соответственно светорассеяния автоматически приводят к ускорению протока жидкости, разбавляющей культуру, и, наоборот, убыль биомассы компенсируется замедлением протока.

Концентрация клеток может оцениваться также по косвенным критериям (по измерению рН, убыли субстрата или накоплению продуктов жизнедеятельности). Непрерывное культивирование, осуществляемое в одном биореакторе, обозначается как одностадийное. Многостадийное культивирование с последовательным или каскадным расположением реакторов позволяет внедрить принцип дифференцированных режимов в непрерывные биотехнологические процессы. Эти дифференцированные режимы не сменяют друг друга во времени, а одновременно осуществляются в последовательно расположенных аппаратах. Например, в первом из биореакторов создают оптимальные условия для роста культуры, а во втором — для биосинтеза целевого продукта.

Принципиальная схема лабораторного биореактора (ферментера) представлена на рис. 2.5.

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.3. Проточные культуры: хемостат, турбидостат

Рис. 2.5. Аппаратурная схема ферментёра-инокулятора: 1 – биореактор; 2 – барботёр; 3 – теплообменная рубашка; 4 – измерительная ячейка; 5 – турбинная мешалка;

6 – термопара; 7 – регулирующий клапан; 8 – контактный термометр; 9 – дифференциальный манометр; 10 – диафрагма; 11 – конденсатор; 12 – сепаратор;

13 – фильтр стерилизации воздуха; 14 – компрессор; 15 – перистальтический насос; 16 – ёмкости для подпитывающих растворов; 17 – электродвигатель; 18 – шкив; 19 – ремень привода; 20 – электро-контактный манометр; 22 – 24, 26 фильтры;

25 – редуктор; 27 – вход и выход воды; 28 – штуцер; 29 – крепёжные гайки; 30 – манометр

Материалыиоборудование:

1.Лабораторный ферментационный комплекс «Bio-Flo»;

2.Стерильные растворы для приготовления питательной среды;

3.Инокулят (посевная культура);

4.ФЭК;

5.Стеклянная посуда, колбы, мерные стаканы, пипетки, бюксы.

Ходработы:

1.В микробиологическом боксе (или боксе-ламинаре) из маточных стерильных растворов приготовить 1 л питательной среды;

2.В обработанную УФ-облучателями комнату внести необходимое оборудование (среда, инокулят);

3.Склянку со средой соединить с насосом-дозатором, подключенным к ферментеру;

4.В ферментер влить инокулят (1 л);

5.Включить аэропомпу;

6.Включить систему перемешивания и термостабилизации;

7.Замерить исходную оптическую плотность (ОП) инокулята;

8.Фиксировать в рабочем журнале (таблица 2.2) температуру культу-

ры;