МОДУЛЬ 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ И ПРОБЛЕМЫ ЗАЩИТЫ

ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Цель – дать представление о возможностях и границах биотехнологии

для защиты окружающей среды.

Задачи:

1.Ознакомление с возможностями биотехнологии для решения задач детоксикации ксенобиотиков;

2.Дать основные понятия и принципы конструирования экологически безопасных для биосферы биопрепаратов.

Работа 5.1. Иммобилизация микробных клеток

Цель работы: обучение принципам иммобилизации клеток микроорганизмов методом механического захвата (включения в гели разных типов).

Иммобилизация – это процесс прикрепления биологических агентов (ферментов, клеток) к поверхности природных или синтетических материалов, включение их в полимерные материалы, полые волокна и мембранные капсулы, поперечная химическая сшивка. Принципы этих технологий в настоящее время получили широкое развитие в связи с новым направлением биотехнологии «Инженерная энзимология». При иммобилизации ферментов происходит стабилизация каталитической активности, иммобилизованный фермент, имеющий ограниченную возможность для конформационных перестроек, быстрее растворимого находит кратчайший путь к функционально активной конформации. Это позволяет организовывать на базе иммобилизованных ферментов эффективные биотехнологические процессы многократного периодического, а также непрерывного действия с использованием принципа взаимодействия подвижной и неподвижной фаз.

Принципы иммобилизации ферментов все более широко используются в настоящее время для иммобилизации клеток, предназначенных для ряда биотехнологических процессов, – биоорганического синтеза, детекции ряда соединений, деградации и связывания токсикантов.

Известны различные методы иммобилизации: адсорбционные методы и методы химического связывания на поверхности, методы механического включения или захвата, методы химического присоединения (рис. 5.1).

МОДУЛЬ 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ И ПРОБЛЕМЫ ЗАЩИТЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Работа 5.1. Иммобилизация микробных клеток

Д

Рис. 5.1. Основные методы иммобилизации: А – абсорбция на крупнопористом носителе; Б – ковалентное связывание; В – адсорбция; Г – поперечная сшивка; Д – включение в гель

Методы иммобилизации путем адсорбции основаны на фиксировании фермента на поверхности различных материалов – неорганических (силикагель, пористое стекло, керамика, песок, обожженная глина, гидроокиси титана, циркония, железа) и органических (хитин, целлюлоза, полиэтилен, ионообменные смолы, вспененная резина, полиуретан с ячеистой структурой). Адсорбция – это самый простой метод иммобилизации ферментов на поверхности нерастворимых носителей. Процедура иммобилизации состоит в смешивании в определенных условиях фермента с носителем и инкубации смеси. Затем при помощи фильтрования и центрифугирования проводят отделение нерастворимого компонента смеси от растворимого. Адсорбция – мягкий метод иммобилизации; недостаток данного метода – непрочность связей. Поэтому при незначительном изменении условий среды (рН, температуры, ионной силы, концентрации продукта) возможна десорбция клеток с поверхности носителя.

Наиболее распространенным методом иммобилизации клеток является включение в полимерную структуру (метод механического захвата). Для этого применяют различные материалы: альгинат, желатину, каррагинан, коллаген, хитин, целлюлозу, полиакриламид. Взвесь клеток смешивают с раствором мономеров носителя. Далее создают условия для процесса полимеризации, в ходе которого происходит механическое включение клеток в структуру носителя. Важным моментом является равномерность распределения клеток в объеме носителя и однородность получаемых агрегатов. Техника включения зависит от природы и свойств используемого материала, образуемые при этом биосистемы имеют вид гранул, волокон, полимерных сеток, пленок и т.п.

На практике для иммобилизации клеток широко применяют полиакриламидный гель (ПААГ), клетки вносят в раствор мономера (N, N1- метилендиакриламида). Далее формируется гель в виде блока. Монолитный гель измельчают, придавая частицам форму кубиков желаемого размера. При использовании желатины или агар-агара вначале подогревают их растворы, затем охлаждают и вносят фермент. В процессе последующего охлаждения происходит формирование геля. Полимеризация альгината происходит в присутствии некоторых катионов. Поэтому на первом этапе смешивают растворы

МОДУЛЬ 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ И ПРОБЛЕМЫ ЗАЩИТЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Работа 5.1. Иммобилизация микробных клеток

фермента и мономеров этих полисахаридов, далее смесь с помощью дозирующего устройства вносят в раствор, содержащий ионы Ca2+ или Ba2+ (для альгината) или Al3+, Fe3+, K+ или Mo2+ (для каррагинана), при этом образуются сферические полимерные частицы в виде гранул.

Гели в зависимости от природы используемого полимерного материала отличаются по ряду показателей. Например, гели ПААГ недостаточно прочные, но этого можно избежать при использовании ПААГ, содержащего жесткую арматуру из керамики. При увеличении степени сшивки с целью придания большей прочности гелю возникают проблемы диффузионных затруднений. Альгинатные гели отличаются высокой прочностью и хорошими гидродинамическими свойствами, что не создает препятствий для притока к активным центрам молекул ферментов субстрата и оттока образуемого продукта. При работе с альгинатом кальция важно отсутствие в иммобилизационной системе хелатирующих агентов (фосфатов, цитратов), которые, связывая кальций, разрушают структуру геля.

Клетки, иммобилизованные на поверхности или в порах носителя или включенные в полимерный матриксы, используются в ряде процессов, прежде всего для очистки сточных вод, газовоздушных выбросов и т. п.

Материалыиоборудование:

1.Биомасса СО-окисляющих микроорганизмов Seliberia carboxydohy-

drogena;

2.Лабораторная центрифуга, бокс-ламинар (или микробиологический бокс);

3.Альгинат, раствор MgSO4, акриламид в наборе с компонентами для полимеризации и образования полиоакриламида (ПААГ), физиологический раствор, стерильная среда Шлегеля;

4.Перистальтический насос-дозатор, магнитная мешалка ММ-3;

5.Колбы объемом 1 л, стаканы, шпатели, чашки Петри, скальпель;

6.Термостатируемая качалка (или лабораторная мешалка);

7.Газгольдер, газовая смесь «воздух:монооксид углерода= 80:20 %об;

8.Газоанализатор для детекции концентрации газов (CO, N2, O2).

Ходработы:

1.Провести включение клеток с использованием двух матри к- сов: альгината и ПААГ: бактериальную пасту ресуспендировать в 0,2 калий-фосфатном буфере при рН 7,0.

2.Приготовить 7 % раствор ПААГ.

3.В раствор ПААГ внести клетки в концентрации 0,1; 0,2; 0,4 и 0,6 г/мл (по сыромувеществу) и хорошо перемешать клетки и охладить до 10С.

4.Охлажденную смесь клеток и раствора носителя разлить в чашки Петри слоем 2 мм и выдерживать в течение 30 мин.

5.Сформированный гель измельчить, используя скальпель, получая частицы в видекубиков размером2 x 2 x 2 мм.

МОДУЛЬ 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ И ПРОБЛЕМЫ ЗАЩИТЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Работа 5.1. Иммобилизация микробных клеток

6.Полученный препарат иммобилизованных клеток хранить в фосфа т- ном буфере в бытовом холодильнике.

7.Включение клеток в альгинат: смешать раствор мономера альгината

склетками (0,5 г сырых клеток/мл).

8.Для формирования геля приготовить 0,1 М трис -HCl буфер при рН 7,0 с добавлением 0,01 М раствора CaCl2.

9.Смесь, содержащую раствор мономера альгината и бактериальные клетки, при постоянном перемешивании на магнитной мешалке с помощью перистальтического насоса дозировать в приемную ванную

(стеклянный стаканчик с раствором CaCl2).По мере прохождения капель через толщу раствора под воздействием ионов магния происходит полимеризация альгната и формируются гранулы диаметром 2,0–2,5 мм.

10.Полученный препарат иммобилизованных клетокхранить в фосфатном буфере в бытовом холодильнике.

Вопросы:

1.В чем специфика конструкции и методов применения биопрепаратов

ибиотехнологий для детоксикации ксенобиотиков?

2.Каковы особенности техники иммобилизации микробных клеток, предназначенных для связывания токсикантов?

3.В чем заключаются «узкие» места применения биопроцессов и биообъектов для защиты окружающей среды от токсинных стоков и газовоздушных выбросов?

Работа 5.2. Принцип работы биофильтра с омываемым слоем. Связывание монооксида углерода в

реакторе иммобилизированными со-окисляющимибактериями

Цель: обучение принципам использования иммобилизованных микробных клеток в биосистеме (биофильтр с омываемым слоем) для связывания токсикантов.

Проблема борьбы с загрязнением воздушного бассейна в условиях возрастающей технологической деятельности приобретает все большую остроту. В воздухе больших промышленных городов содержится огромное количество вредных веществ. При этом концентрация многих токсикантов превышает допустимые уровни. Основной вклад в загрязнение атмосферы вносят предприятия нефтеперерабатывающей, химической, пищевой и перерабатывающей промышленности, а также большие сельскохозяйственные комплексы, отстойники сточных вод, установки по обезвреживанию отходов. Среди этих веществ – органические (ароматические и непредельные углеводороды, азот-, кислород-, серо- и галогенсодержащие соединения) и неорганические вещества (сернистый газ, сероуглерод, окислы углерода, аммиак, хлорводород, галогены). В воздушных бассейнах больших промышленных

МОДУЛЬ 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ И ПРОБЛЕМЫ ЗАЩИТЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Работа 5.2. Принцип работы биофильтра с омываемым слоем.

городов присутствуют десятки различных соединений, в том числе дурнопахнущие, способные даже в незначительных концентрациях представлять угрозу для здоровья, а также вызывать у людей чувство дискомфорта.

Для очистки воздуха применяют различные методы – физические, химические и биологические, однако уровень и масштабы их использования в настоящее время чрезвычайно далеки от требуемых. Среди применяемых физических методов – абсорбция примесей на активированном угле и других поглотителях, абсорбция жидкостями. Наиболее распространенными химическими методами очистки воздуха являются озонирование, прокаливание, каталитическое дожигание, хлорирование. Биологические методы очистки газовоздушных выбросов начали применять сравнительно недавно и пока в ограниченных масштабах.

Биологические методы очистки воздуха базируются на способности микроорганизмов разрушать в аэробных условиях широкий спектр веществ и соединений до конечных продуктов, СО2 и Н2О.

Для биологической очистки воздуха применяют три типа установок: биофильтры, биоскрубберы и биореакторы с омываемым слоем.

Рабочим телом биореактора с омываемым слоем являются иммобилизованные микроорганизмы. Биослой реактора представляет собой гранулы с иммобилизованными микробными клетками. Этот слой омывае т- ся водой, содержащей необходимые для развития клеток минеральные вещества. Загрязненный воздух проходит через него, при этом вещества, подлежащие деструкции, диффундируют в водную пленку, покрывающую частицы биокатализатора, и далее окисляются микроорганизмами. Скорость деструкции может лимитироваться скоростью диффузии веществ из газовой фазы в жидкую, а также скоростью протекания реакций в микробных клетках. Скорость диффузии, в свою очередь, зависит от природы токсических веществ и их концентраций. Стационарный режим биореактора с омываемым слоем после его запуска наступает через 5–10 дней. При использовании заранее адаптированных к очищаемым вещ е- ствам микроорганизмов этот срок может быть сокращен до нескольких часов. Периодически, обычно раз в несколько месяцев, биослой очищ а- ют от избытка биомассы и наполняют свежими гранулами. Эти установки наиболее перспективны для очистки воздуха. Они характеризуются более высокой удельной производительностью (несколько тысяч кубометров очищаемого воздуха в час). Такие малогабаритные установки очень эффективны для очистки воздуха предприятий интенсивного животноводства. Степень очистки воздуха в реакторе с иммобилизованн ы- ми на активированном угле микроорганизмами от ацетона, бутанола, пропионового альдегида, этилацетата достигает 90 % при удельной производительности установки 10 000 ч–1.

Способность микроорганизмов усваивать для роста субстраты токсической природы важна для понимания механизмов устойчивости биологических объектов к воздействию токсикантов, а также представляет большой интерес в экологическом плане. Биокаталитический потенциал

МОДУЛЬ 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ И ПРОБЛЕМЫ ЗАЩИТЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Работа 5.2. Принцип работы биофильтра с омываемым слоем.

микроорганизмов, утилизирующих разнообразные токсические соединения — загрязнители атмосферы с образованием безвредных продуктов, в последние годы стали использовать и в биологических системах очистки газовоздушных выбросов металлургических, химических и других производств, а также крупных животноводческих комплексов.

Окись углерода является одним из наиболее токсичных загрязнителей атмосферы. Карбоксидобактерии, обладающие специфической ферментной системой окисления окиси углерода, СО-оксидазой (СОХ), широко распространены в природе и являются мощным агентом удаления СО из атмосферы. Это позволяет рассматривать данные микроорганизмы в качестве потенциального реагента для применения в биосистемах связывания и детоксикации окиси углерода.

Материалыиоборудование:

1.Препараты с иммобилизованными клетками СО-окисляющих бактерий в виде полимерных гранул;

2.Колбы объемом 1 л, стеклянный цилиндр, лабораторные штативы;

6.Лабораторная мешалка ММ-3, лабораторный мини-компрессор;

7.Газгольдер, газовая смесь «воздух:монооксид углерода= 80:20 %об.;

8.Газоанализатор для детекции концентрации газов (CO, N2, O2).

Ходработы:

1.Препарат иммобилизованных в альгинате кальция клеток карбоксидобактерий использовать в качестве наполнителя в лабораторных макетах биофильтров для исследования возможности утилизации окиси углерода из воздуха.

2.Первый тип биореактора (рис. 5.2, а): навеску альгинатных гранул диаметром 2,5 мм внести в колбу 1 л объемом 100– 150 мл 0,1 М трис-HCl буфер при рН 7,0; в бу фер для стабилизации гранул добавить 10 мМ раствор хлорида кальция.

3.Собрать второй тип биореактора (рис. 5.2, б): взять стеклянный

цилиндр диаметром 64 мм, высотой 190 мм, в который помещали 150 см3 гранул и 250 мл буфера.

4.Собрать макет биофильтра, представляющий собой замкнутую по газу систему, состоящую из реактора с омываемым слоем (колба, приготовленная по п. 2, или цилиндр п. 3, содержащие иммобилизованные клетки в жидкой фазе), газометра, заполненного смесью воздуха с окисью углерода, а также компрессора, с помощью которого газовая смесь непрерывно прокачивается через биореактор.