МОДУЛЬ 6. КЛЕТОЧНАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Работа 6.1. Трансформация клеток E. coli xli-Blue плазмидой pGLO

-DNA, LB

2.Опишите, какие новые свойства приобрели трансформированные бактерии. Благодаря чему?

3.Определите эффективность трансформации по формуле

Эфф. трансф. = число колоний на чашке / кол-во ДНК на чашку (мкг)

1.Определите число колоний, выросшее на чашках (+DNA, LB/amp) и

(+DNA, LB/amp/ara).

2.Количество ДНК определите исходя из концентрации раствора ДНК

иего количества, взятого для трансформации. Запишите проведенные расчеты и полученные результаты.

Вопросы:

1.Что такое генетическая трансформация?

2.Что такое компетентные клетки? Как вы себе представляете процесс проникновения плазмидной ДНК внутрь клеток в момент температурного шока?

3.Почему для проведения генетических модификаций чаще всего используют клетки E.coli? Какие еще организмы используются в биотехнологии?

4.Какова эффективность проведенной вами трансформации? От чего она зависит? Почему клетки на чашке +DNA, LB/amp выросли, но не флюоресцируют?

5.Как вы думаете, о чем бы свидетельствовала флюоресценция клеток, выросших на чашке +DNA, LB/amp?

Работа 6.2. Экспрессия генов, клонированных в прокариотических системах.

Культивирование рекомбинантных клетокE.coli

Цель работы: культивирование рекомбинантных клеток E.coli BL21(DE3) с контролируемой экспрессией двух различных белков: рекомбинантного белка апообелина (плазмида рЕТ-OL8) и химерного белка proZZObe (плазмида pTZZO2).

В работе используется штамм E.coli BL21(DE3). Помимо жесткой регуляции экспрессии этот штамм лишен ряда протеолитических ферментов, что способствует уменьшению протеолитического расщепления рекомбинантных белков в клетке-хозяине.

Материалыиоборудование:

1. Трансформированные клетки;

МОДУЛЬ 6. КЛЕТОЧНАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Работа 6.2. Экспрессия генов, клонированных в прокариотических системах.

2.Стерильная LB среда;

3.Стерильные колбы объемом 100 мл – 2 шт.; 1 л – 2 шт.;

4.Ампициллин (р-р , 200 мг/мл);

5.ИПТГ (изопропил –β-D-тиогалактопиранозид);

6.Микробиологический бокс;

7.Термостатированный шейкер;

8.Фотоэлектроколориметр (ФЭК) и кюветы к нему;

9.Центрифуга с охлаждением и центрифужные стаканы к ней;

10.Весы для уравновешивания центрифужных стаканов;

11.Набор автоматических пипеток и наконечников к ним.

Ходработы:

1. Подписать колбы для культивирования «Obe» и «proZZ-Obe».

2. В стерильных условиях внести в 100 мл колбы по 20 мл стерил ьной LB-среды, раствор ампициллина до конечной концентрации 200 мкг/мл и 2–3 среднего размера колонии соответствующих бактерий. Инкубировать при 37 оС при активном перемешивании до плотности Д590 = 0,5–0,6. Оптическую плотность измерять через каждые 45–60 мин с помощью ФЭКа против исходной среды. Пробу отбирать стерильными наконечниками.

4.Полученную культуру поместить в холодильник до следующего утра. Отцентрифугировать клетки с помощью центрифуги К-23 (3–4 тыс.

об/мин,

5 оС, 15 мин).

5.В колбы объемом 1 л с 200 мл стерильной LB-среды внести раствор ампициллина до конечной концентрации 200 мкг/мл. Стерильно перенести клетки в эти колбы, суспендируя их свежей стерильной LB-средой.

6.Инкубировать при 37 оС при активном перемешивании. Следить за

ростом клеток, измеряя оптическую плотность ОД590 против исходной среды через каждый час.

7.При плотности ОД590 = 0,6–0,8 отобрать по 1 мл культуры и отцентрифугировать на микроцентрифуге. Хранить образец клеток до индукции при –20 оС. Провести индукцию транскрипции рекомбинантного белка. Для этого в колбы добавить сухую навеску ИПТГ (до концентрации 100 мг/л).

8.Продолжить культивирование еще в течение трех часов, следить за ростом как описано в п. 3. Отобрать аликвоту клеточной суспензии, равную количеству клеток до индукции, отцентрифугировать и хранить образец, как описано в п. 4.

9.Построить кривую роста оптической плотности Д590 от времени.

10.Бактерии отделить центрифугированием, как описано в п.1.

11.Промыть клетки, ресуспендируя физраствором (0,9 % NaCl), и вновь отцентрифугировать. Взвесить полученную клеточную пасту.

Вопросы:

1. Для чего нужна регуляция экспрессии рекомбинантных белков?

МОДУЛЬ 6. КЛЕТОЧНАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Работа 6.2. Экспрессия генов, клонированных в прокариотических системах.

2.Какие регуляторные участки должны присутствовать в экспрессируемой плазмиде?

3.Ген экспрессируемого в Е.coli белка находится под промотором РНК полимеразы фага Т7. Какие гены должны присутствовать в клетке-хозяине, чтобы экспрессия была эффективной?

4.Каковы свойства клеток Е.coli BL21(DE3), которые вы использовали

для экспрессии рекомбинантных белков?

5.Опишите регуляторные механизмы экспрессии в системе рЕТ, пользуясь рис.11. Нарисуйте схематически плазмиды для экспрессии апообелина

ихимерного белка.

6.Что такое ИПТГ? Что происходит в трансформированных клетках после его добавления в питательную среду?

7.В каких условиях производится культивирование трансформирован-

ных клеток Е.coli BL21(DE3)?