МОДУЛЬ 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
Работа 1.1. Планирование эксперимента и построение модели на примере выращивания микроорганизмов
12. Провести расчет дисперсии коэффициентов регрессии:
S 2
Ski2 = Ny .
13. Проверить значимость коэффициентов регрессии: Рассчитать коэффициент Стьюдента
tip = SB2i ,
ki
где Bi – коэффициент регрессии: |
|
|
||
Определить табличный коэффициент Стьюдента tst и проверить усло- |
||||
вие tip14.< tstПровести. |
расчет адекватности дисперсий: |
|||
|
Sad2 = |
|
m |
∑N (ycp − y *)2 , |
|
|
|
||
|
|
N −m i=1 |
||
где уср – среднее значение из всех повторностей в каждой строке; y* – значение, рассчитанное по уравнению регрессии.
15. Провести расчет адекватности модели: расcчитать критерий Фишера
Fp= S2ad/S2y;
определить табличный критерий Fтаб и осуществить их сравнение. 16. Провести анализ полученной модели.
Вопросы:
1.Каков порядок планирования эксперимента?
2.В чем заключаются основные положения метода наименьших квадра-
тов?
3.Каким образом осуществляется проверка адекватности модели?
4.Назовите достоинства и недостатки однофакторного эксперимента.
Работа 1.2. Модели роста микроорганизмов
Цель работы: построение модели для расчета удельной скорости роста биомассы в условиях сбалансированного субстрата при гетеротрофном культивировании бактерий Ralstonia eutropha.
Задача составления уравнения для расчета скорости роста популяции может быть решена на основе анализа механизма протекающих в клетке процессов, основу которых составляют последовательности ферментативных ре-
Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам |
-10- |
МОДУЛЬ 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «БИОТЕХНОЛОГИЯ
Работа 1.3. Фазы роста микробиологических культур и расчет кинетических параметров
акций. Однако этот путь является практически мало применяемым вследствие того, что исследованных к настоящему времени внутриклеточных реакций много и нет возможности построить математическую модель с большим количеством сложных реакций. Другой путь решения поставленной задачи построения модели, сводится к анализу лишь некоторого числа переменных, характеризующих развитие популяции, или конечного числа обобщенных ферментативных реакций ответственных за эти переменные. В этой связи, разработка математической модели кинетики сводится к объединению групп процессов, протекающих в клетках, анализу влияния факторов среды на протекание процессов и идентификации параметров модели.
В качестве низшего уровня при разработке кинетической модели обычно рассматривают исследования, связанные с анализом внутриклеточных процессов. При этом достаточная глубина разработки кинетической модели может быть реализована при рассмотрении кинетики роста микробных популяций с учетом обобщенных ферментативных реакций, возрастной неоднородности клеточной популяции и физиолого-биохимической структуры популяции. На более высоком иерархическом уровне рассматриваются кинетические модели утилизации субстрата, роста клеток и образования продукта (рис. 1.1).
Модель популяции микроорганизмов
Кинетика |
утилизации |
субстрата |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Кинетика |
|
|
Кинетика |
|
||||
|
роста |
|
|
|
образования |
|
|
клеток |
|
|
|
продуктов |
|
|
|
|
|
метаболизма |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Кинетика обобщенных |
ферментативных реакций |
Кинетика с учетом |
возрастной неоднородности |
Рис. 1.1. Иерархическая схема разработки кинетической модели популяции микроорганизмов
В данной работе рассматривается кинетика утилизации субстрата при гетеротрофном культивировании бактерий. При культивировании водородных бактерий Ralstonia eutropha обычно используется сбалансированный питательный состав, за основу которого принята солевая среда Шлегеля:
Na2HPO4·H2O – 9,1; KH2PO4 – 1,5; MgSO4·H2O – 0,2; Fe3C6H5O7·7H2O – 0,025
(г/л). Микроэлементы вводятся по прописи Хоагланда из расчёта 3 мл стандартного раствора на 1 л среды. Стандартный раствор содержит: H3BO3 –
0,288; CoCl2·6H2O – 0,030; CuSO4·5H2O – 0,08; MnCl2·4H2O – 0,008; ZnSO4·7H2O – 0,176; NaMoO4·2H2O – 0,050; NiCl2 – 0,008 (г/л). В качестве субстратов могут быть приняты хлористый аммоний и фруктоза.
Из ферментативного катализа известны две принципиально различные простейшие кинетические схемы, приводящие к дискриминируемым зависимостям скорости процесса от концентраций двух субстратов. С учетом авто-
Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам |
-11- |
МОДУЛЬ 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «БИОТЕХНОЛОГИЯ
Работа 1.3. Фазы роста микробиологических культур и расчет кинетических параметров
каталитического процесса микробного роста эти две схемы могут быть представлены в следующем виде:
S2 |
(1) |
S1+N↔S1N ↔S1S2N→2N+P ; |
S1+N↔S1N→X+P
S2+X ↔S2X→2N+P, (2)
где S1 и S2 – концентрации субстратов; N – «ненасыщенная» форма клетки; X – «насыщенная» форма клетки, способная к делению; P – продукт.
Механизм (1) включает две обратимые равновесные стадии присоединения субстратов (механизм тройного комплекса). Механизм (2) включает стадии присоединения субстратов, которые, по крайней мере, разделены одной необратимой стадией (пинг-понг-механизм).
Для механизма группы (2) характерна следующая зависимость от концентрации субстратов:
µ = |
|
µm |
|
|
|
, |
(3) |
||
|
K |
|
|
K |
|
||||
1 + |
|
1 |
+ |
|
2 |
|
|
|
|
|
|
S2 |
|
||||||
|
|
S1 |
|
||||||
где K1 и K2 – эффективные константы сродства микроорганизма к субстратам
S1 и S2Для. механизмов группы (1) уравнение удельной скорости роста может быть записано в виде
µ = |
|
|
µm |
|
|
|
|
. |
(4) |
|
|
K |
|
|
K |
K |
|
||||
1 + |
|
2 |
+ |
1 |
|
2 |
|
|
|
|
|
|
S1S2 |
|
|||||||
|
|
S2 |
|
|||||||
Дальнейшие исследования сводятся к анализу уравнений (3) или (4). Для этого проводят исследования и строят зависимость вида
µ = f( S1;S2) (рис. 1.2).
Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам |
-12- |
МОДУЛЬ 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «БИОТЕХНОЛОГИЯ
Работа 1.3. Фазы роста микробиологических культур и расчет кинетических параметров
µ, ч-1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0.25 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0.2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0.15 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0.1 |
|
|
|
|
|
|
|
- 1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
- 2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
- 3 |
|
0.05 |
|
|
|
|
|
|
|
- 4 |
|
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
0 |
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
S1 , кг/м3 |
|
Рис.1.2. Изменение удельной скорости роста суммарной биомассы
от концентрации фруктозы S1. Экспериментальные точки (1–4):
1 – S2 = 1,2 кг/м3; 2 – 0,6; 3 – 0,4; 4 – 0,2
Обработка экспериментальных данных (рис. 1.3–1.4) позволяет получить значения эффективных констант сродства микроорганизма к субстратам
K1 и K2.
1/µ, ч
|
- 1 |
|
tgϕ = |
Kаз |
+ |
KазKфр |
|
|
|
|
- 2 |
|
|||||
|
|
|
µm |
µm X фр |
||||
10 |
- 3 |
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|||
8
6
4
2
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 1/Xаз, м3/кг |
Рис. 1.3. Зависимость удельной скорости роста суммарной биомассы
от концентрации субстратов в обратных координатах. Точки (1 – 3, данные рис.1.2):
1 – Xфр = 1кг/м3; 2 – 2,5; 3 – 8. Точки (1 – 3): 1 – Xфр = 1кг/м3; 2 – 2,5; 3 – 8
1/µm, ч
4.5
4
µm = 1/3.6 ; Kаз = µm × tg ϕ = 0.277×0.18 = 0.05
3.5
0 |
1 |
3 |
4 |
5 1/Xаз,м3/г |
Рис. 1.4. Зависимость кинетических параметров 1/µm от 1/Xаз
Материалыиоборудование:
1.Музейная культура штамма R. eutrophus B-5786;
2.Стерильный раствор базового фосфатного буфера для среды;
Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам |
-13- |