Хід роботи

Студенти розділяють на бригади по 4 особи, проводять попереднє тренування в нанесенні води на звичайний папір за допомогою шприца.

Кожна бригада одержує:

- листок хроматографічного паперу;

- 2 пробірки з розчином амінокислоти відомої концентрації (1-ша пробірка) та розчином амінокислоти невідомої концентрації (2-га пробірка);

- 5 пробірок з 5 мл 0,005%-го розчину сульфату міді в 75%-му етиловому спирті;

- шприци, ножиці.

На листку хроматографічного паперу олівцем відмічають лінію старту та 4 точки для нанесення розчинів амінокислот. На 1, 2, 3 точки наносять розчини амінокислоти відомої концентрації на 4-ту точку наносять розчин амінокислоти невідомої концентрації (рис. 2.4.).

Шприцем наносять на 1-шу точку 1 краплину (5 мкл) розчину, на 2-гу точку 2 краплини (10 мкл), на 3-тю – 4 краплини (20 мкл) 0,01 М розчину амінокислоти або 0,05; 0,1; 0,2 мкмоль амінокислоти. На 4-ту точку наносять 2 або 3 краплини амінокислоти невідомої концентрації.

___х__ __х__ __х ___х_____ 1 2 3 4

Рис. 2.4.Нанесення точок на хроматографічний папір

Розчини на кожну точку наносять після повного висушування попе-редньо нанесеного об'єму амінокислоти. Після нанесення амінокислоти на всі точки хроматографічний папір висушують на повітрі, а потім занурюють на кілька секунд у кювету з 0,5 %-м р-ном нінгідрину в ацетоні, просушують у витяжній шафі при кімнатній температурі і 15 хв прогрівають у термостаті при 60°С для проявлення забарвлення.

Зони хроматограми з яскраво-ліловими плямами амінокислот вирізають.

Збоку хроматографічного листка паперу на чистому місці вирізають кружок паперу (контрольна зона для порівняння), що дорівнює за площею дослідним.

Вирізані зони паперу (зони 4-рьох точок та контрольна зона вирізана на чистому полі), подрібнюють ножицями і вміщують в 5 окремих пробірок, які підписують згідно з номером точки та контрольної зони.

В кожну пробірку додають 5 мл 0,005%-го розчину сульфату міді в 75%-му етиловому спирті. Лілове забарвлення амінокислот переходить в оранжево-червоне внаслідок утворення Cu-похідного ДІДА і відбувається екстракція комплексної сполуки амінок-ти з паперу в розчин.

Для повної екстракції пробірки на 30 хвилин ставлять у темне місце при кімнатній температурі. Потім проби фотометрують проти контролю (пробірка з розчином контрольної зони) на ФЕК при довжині хвилі 540 нм (зелений світлофільтр), кювета 5 мм.

На основі знайденої оптичної густини для точок 1, 2, 3 та концентрацій амінокислоти, що відповідають цій оптичній густині будують в зошиті калібрувальний графік, де на осі абсцис відкладають концентрацію амінокислоти в мкмоль/мл, а на осі ординат – оптичну густину (показання ФЕК (рис. 2.5.).

За знайденою оптичною густиною амінокислоти невідомої концентрації (пробірка 4) визначають її концентрацію по калібрувальному графіку.

Рис.2.5. Калібрувальний графік для визначення концентрації розчину амінокислоти