Лабораторна робота 1 розділення амінокислот методом тшх на силуфолових пластинках

Мета роботи: Вивчити хроматографічний метод роз­ділення амінокислот з використанням розподільної хроматографії на силуфолових пластинках.

План

1. Інструкція з охорони праці при проведенні робіт у навчальних лабораторіях кафедри

2. Визначення хроматографії, класифікація методів хроматографії.

3. Розподільна хроматографія в тонкому шарі.

4. Хроматографічна рухомість.

Реактиви

1. Суміш розчинників н-бутанол, оцтова к-та, вода в обємному співвідношенні 4:1:5 (40 мл н-бутанолу, 10 мл оцтової к-ти, 50 мл дист. води) струшують протягом 1-2 хв. в ділильній воронці. Після розшарування нижній шар зливають, а верхній використовують як рухому фазу.

2. 0,5%-й розчин нінгідрину в ацетоні (95 частин 0,5%-го розчину нінгідрину в ацетоні, 1 частина льодяної оцтової к-ти і 4 частини води) змішують безпосередньо перед визначенням.

3. 0,03 М розчини різних амінокислот (наважку амінокислот, що відповідає 0,03 М розчину, розчиняють в 0,01 н соляній кислоті).

4. Розчини суміші амінокислот невідомої концентрації.

Матеріали та обладнання

Силуфолові пластинки, шприци, контейнери з кришкою для суміші розчинників, контейнери з кришкою для розчину нінгидрину, витяжна шафа, термостат або сушильна шафа, лінійка, олівець

Загальні відомості

Хроматографія (хромо — колір, графо — пишу) це фізико-хімічний метод розділення рідких та газоподібних сумішей на складові.

Хроматографічний метод, описаний вперше М.С. Цвєтом у 1903 р., широко використовується в біохімії, мікробіології, а також у промисловості для одержання, очи­стки та ідентифікації органічних та неорганічних сполук. Він дає змогу розді­ляти та аналізувати складні суміші речовин, очищати їх від домі­шок, концентрувати та ідентифікувати речовини.

Всі хроматографічні системи складаються, як правило, з двох фаз: нерухомої, яка може бути твердою або рідкою, та рухомої, яка рухається по нерухомій фазі. Рухома фаза, в потоці якої переміщується суміш, що розподіляється, називається елюентом, а розчин, який виходить з шару нерухомої фази та містить розчинені компоненти суміші –елюатом.

Поведінка молекул в хроматографічних процесах визначається будовою та характером хімічних звязків між окремими атомами та групами, взаємодією частинок речовини що розділяється і фази, з якою ці частинки стикаються.

Хроматографічні методи класифікують за такими ознаками:

1. За агрегатним станом — газова, рідинна, газорідинна хроматографія;

2. За механізмом розділення — адсорбційна, іонообмін­на, розподільна хроматографія.

3. За формою проведення процесу — колоночна, капілярна, площинна.

За напрямком руху елюента (рухома фаза) площинну тонкошарову хроматографію розділяють на висхідну та низхідну:

- якщо елюент рухається знизу вверх, хроматографія називається  висхідною(А);

- якщо зверху вниз - низхідною (Б) хроматографією (рис. 1.1).

Рис.1.1. Тонкошарова хроматографія.

А – висхідна; Б – низхідна (вид збоку); В – хроматограма з розділеними і проявленими плямами амінокислот: 1 – фронт розчинника, 2 – розділені амінокислоти, 3 – місце нанесення зразка.

Для характеристики поведінки зон речовин, що хроматографуються у паперовій хроматографії вводять величину хроматографічної рухомості R_f:

Хроматографічна рухомість R_f(рис. 1.2)речовини в даній системі розчинників характеризується відношенням:

- відстані між стартом(точкою нанесення речовини на хроматограму) та положенням максимума концентрації в плямі речовини на хроматограмі до відстані, що пройшов розчинник від лінії старту до лініїфінішу(відповідає положенню фронту рідини, зупиненому на певній відстані від краю пластинки).

l

R_f = ----- , де

L

l - шлях, пройдений розчиненим компонентом від старту до центру

плями;

L -шлях, пройдений фронтом розчинника від старут до фінішу.

На величину R_f впливає наявність в речовині функціональних груп

(-СООН, -ОН, -NН₂, -NO₂, -H, -Cl), водневі звязки всередині молекули амінокислоти, що знижують розчинність речовин в воді та полярних розчинниках, температура плавлення, електролітична дисоціація, здатність до утворення комплексних сполук, рН рухомої фази та ін.

Рис. 1.2. Визначення R_f компонентів суміші

Розподільна хроматографія в тонкому шарі (ТШХ).

У цьому методі хроматографія відбувається в тонкому шарі сорбенту нанесеному на тверду інертну пластинку. Найбільшого поширення набули пластинки з підкладкою виготовлену з алюмінієвої фольги або полімеру. Частіше всього адсорбентом може бути сілікагель, оксид алюмінію, целюлоза, поліамід та ін. Для більш міцного закріплення адсорбента на жорсткій пластині-підложці використовують реагенти для звязування (гіпс, крохмаль, силіказоль та ін.).Суміш адсорбента з цим реагентом наносять на підложку дуже тонким шаром (біля 100 мкм).

Ми користуємося цим видом хроматографії для визначення амінокислот в суміші, що наноситься на силуфолову пластинку.

В якості рухомої фази використовується суміш розчинників н-бутанол : оцтова кислота : вода у співвідношенні 4:1:5, відповідно. Відносне положення амінокислот на хроматограмах, отриманих в даній суміші показано на рисунку 1.3.

лейцин (ізолейцин). фенілаланін валін метіонін тирозин про­лін аланін треонін глутамінова кислота гліцин серин аспарагінова кислота аспарагінова кислота лізин, гістидин цистин

Рис. 1.3. Відносне положення амінокислот на хроматограмах

Підготовка до проведення лабораторної роботи

Студенти розділяються на бригади по 4 особи.

Лаборант видає кожній бригаді 1 силуфолову пластинку. Щоб запобігти забрудненню силуфолової пластинки її необхідно обережно тримати за бокові грані.

Для загального доступу лаборант готує розчини відомих амінокислот для кожної бригади та суміш невідомих амінокислот відповідно до номера бригади.

Бригади одержують завдання, які амінокислоти взяти для виконання роботи та № суміші невідомих амінокислот (згідно номера бригади).

1 бригада – аргінін, валін, гліцин. Суміш №1

2 бригада – аспарагінова к-та, лейцин, треонін. Суміш №2

3 бригада – гліцин, лізин, фенілаланін. Суміш №3

4 бригада – треонін, фенілаланін, серин. Суміш №4

5 бригада – аргінін, глутамінова кислота, лейцин. Суміш №5

6 бригада – серин, треонін, валін. Суміш №6

7 бригада – фенілаланін, аспарагінова кислота, аланін. Суміш №7

8 бригада – валін, аспарагінова кислота, тирозин. Суміш №8

9 бригада – серин, лейцин, треонін. Суміш №9

Студенти проводять попереднє тренування в нанесенні води на звичайний папір за допомогою шприца. Олівцем підписують пластинку (прізвище та № бригади).

Члени бригади беруть пробірки з розчинами відомих амінокислот, наносять їх на точки 1, 2 та 3 на пластинці і повертають розчини на стіл. Потім беруть розчин суміші невідомих амінокислот відповідно номеру бригади і наносять на точку 4.