Рекомендована література

1. Пентин, Ю.А. Основы молекулярной спектроскопии/ Ю.А.Пентин. - М.: Мир, 2008.- 398 с.

2. Шмидт, В. Оптическая спектроскопия для химиков и биологов / В. Шмидт.- М.: Техносфера, 2007. - 368 с.

3. Нельсон, Д. Основы биохимии Ленинджера. В 3 т. / Д. Нельсон, М. Кокс. - М.: Бином. Лаборатория знаний, 2012. - 694 с.

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА 7

ВИЗНАЧЕННЯ КОНЦЕНТРАЦІЇ РОЗЧИННОГО БІЛКУ ЗА МЕТОДОМ ЛОУРІ ТА МЕТОДОМ БРЕДФОРДА

Мета роботи: навчитися визначати концентрацію білку в розчині за методом Лоурі та методом Бредфорда.

План

1. Методи кількісного визначення концентрації білків.

2. Визначення концентрації розчинних білків за методом Лоурі.

3. Побудова калібрувальної кривої.

4. Визначення концентрації розчинних білків за методом Бредфорда.

Реактиви

1. Для методу Лоурі:

Реактив 1– 2%-ний розчинNa₂CO₃в 0,1Н розчиніNaOH;

Реактив 2– 0,5%-ний розчинCuSO₄5H₂Oв 1%-ному розчині двозамі-щеногоNa-цитрату або К-тартрату;

Реактив 3– готується перед роботою: змішують 50 мл реактиву А та 1 мл реактиву Б. Придатний для використання протягом 2 діб;

Реактив 4. Реактив Фоліна-Чокальтеу. 10 г Na₂Wo₄∙2H₂O (перекриста-лізований) і 2,5 г Na₂MoO₄∙2H₂0 вміщують в круглодонну колбу на 200 - 250 мл, приливають 70 мл води і добре перемішують. До одержаного розчину додають 5 мл 85%-го розчину Н₃РО₄ і 10 мл концентрованої HCl (x.ч.). Колбу приєднують до зворотного холодильника з шліфом і кип'ятять протягом 10 годин. Потім в розчин додають 15 г Li₂SO₄, 5 мл води і одну краплю брому. Розчин перемішують і нагрівають для видалення брому. Потім охолоджують, доводять водою до 100 мл, фільтрують і разводять водою до одержання 1 н. розчину. Кислотність визначають титруванням разведенного в 10 разів реактиву 0,1 н. лугом в присутності фенолфталеїну. Після приготування зберігається в темній склянці довгий час.

2. Для методу Бредфорда:

100 мг кумассі розчиняють в 50 мл спирту і додають 100 мл ортофосфор-ної кислоти, доводять водою до об'єму 1л і фільтрують через бумажний фільтр. Чистий реактив Бредфорда має коричневий колір і синіє в присутності білку. Для побудови калібрувального графіку беруть бичий сироватковий альбумін (БСА).

3. Розчин білку невідомої концентрації.

Матеріали та обладнання

ФЕК з довжиною хвилі 750 нм та 595 нм, кювети з довжиною оптичного шляху 5 мм та 1 мм, аналітичні ваги, мірні колби, штатив з 7 пробірками для кожної бригади, піпетки місткістю 0,1; 1,0 та 5,0 мл.

Загальні відомості

Методи визначення концентрації білків. Білки це біологічно активні речовини, що відіграють ключову роль в життєдіяльності клітин живої матерії.

До складу білків входять вуглець, водень, азот, кисень, сірка. В деяких білках присутні такі елементи як фосфор, залізо, цинк, мідь, молібден. Активні центри ферментів можуть мати кілька молекул рідкісних металів таких як ванадій. Білки мають велику молекулярну масу, але при кислотному гідролізі утворюють ряд простих, низькомолекулярних сполук, що відносяться до класу -амінокислот.

В білкових молекулах послідовно розташовані амінокислотні залишки ковалентно повязані пептидними звязками один з одним, утворюючи довгі нерозгалужені полімерні ланцюги. Пептидні звязки утворюються в результаті вилучення молекули води з карбоксильної групи однієї амінокислоти і  -аміногрупи іншої (-СО-NН-). Такі полімерні молекули називаються поліпептидними ланцюгами і можуть мати сотні амінокислотних залишків. Молекула білку може складатися з одного або кількох поліпептидних ланцюгів.

Кількісне визначення концентрації білків у розчині може бути проведене різними методами:

1. Визначення азоту (метод Кєльдаля). Метод заснований на повному гідролізі молекули білку під дією сірчаної кислоти у присутності каталізатора. Метод вимагає великої кількості білку та значних затрат часу.

2. Амінокислотний аналіз (рис.7.1). Метод амінокислотного аналізу проводиться методом Високоефективної рідинної хроматографії і є найбільш швидким серед традиційних методів дослідження. Метод використовує внутрішні мічені стандарти для точнішого і достовірнішого кількісного аналізу.

3. Колориметричні методи. Колориметричні методи визначення загального білку засновані на кольорових реакціях білків з реактивами або на неспецифічному зв'язуванні білку з барвником. Досить прості у відтворенні, потребують невеликої кількості білку (Біуретовий метод, Біуретовий метод у модифікації Ярош, метод Лоурі, метод Бредфорда).

4. Спектрофотометричний метод заснований на здатності ароматичних амінокислот (трип­тофану, тирозину і фенілаланіну) поглинати ульт­рафіолетові промені при 280 нм. Вимірюючи величину опти­чної щільності при цій довжині хвилі, знаходять кількість білку в розчині.

Оскільки білки відрізняються за вмістом ароматичних амінокислот, їх поглинання в ультрафіолетовій області спектра мо­жет відрізнятися.

5. Флюориметричні та інші сучасні методи визначення загального білку (наприклад, полярографічний мікрометод або атомно-абсорбційний аналіз) мають високу чутливість і специфічність, але потребують спеціального обладнання та спеціальної кваліфікації для дослідника, що разом з високою вартістю високою вартістю визначення значно обмежує його використання.

Рис. 7.1. Хроматограма разділеної суміші амінокислот. Кількість кожної амінокислоти становить 10 наноМоль

Ми розглянули в Лабораторній роботі 3 методи визначення концентрації білку в розчині з біуретовим реактивом та з біуретовим реактивом в модифікації Ярош.

В даній лабораорній роботі будуть розглянуті методи Лоурі та Бредфорда.

Метод Лоурі  є найпоширенішим з  колориметричних  методів кількісного визначення білків в розчині був представлений в 1951 році. Посилання на цей метод є найчастіше згадуваною науковою статтею.

Метод Лоурі дає змогу виміряти інтенсивність забарвлення розчину, у якому одночасно здійснюються дві кольорові реакції на білок: реакція Фоліна - відновлення білками суміші фосфатно-вольфрамової та фосфатно-молібденової кислот - реактиву Фоліна з утворенням комплексного з'єднання синього кольору. Синє забарвлення, що виникає, в основному визначається реакцією фенольного реагенту з залишками амінокислоти Tyr, деякий вклад вносять інші амінокислоти Trp, His, Cys та пептидні звязки. У реакції відновлення беруть участь комплексні з'єднання міді, що утворилися при взаємодії білку в лужному розчині мідного купоросу.

Друга із згаданих реакцій не дуже специфічна, зате досить чутлива. Тому метод Лоурі дозволяє вести визначення білків у дуже розведених розчинах, де кількість їх виражається всього лише десятками мікрограмів.

Інтенсивність забарвлення комплексів вимірюють на фотоелектроколори-метрі (ФЕК) в кюветі 5 мм при довжині хвилі при довжині хвилі 750 нм (червоний світлофільтр) або на спектрофотометрі.

Ha розвиток забарвлення впливає велика кількість речовин: компоненти буферних систем, відновники, комплексоны (ЭДТА в концентрації 0, 5 мМ), детергенти (тритон X100 в концентрації 0,1 - 0,2 %), сірчанокислий амоній в концентрації 0,15 %, сахароза в концентрації 10 % та ін.

У зв'язку з цим при побудові калібрувального графіку для визначення білку за методом Лоурі в розчинник для стандартного білку необхідно включати усі компоненти, що містяться в аналізованій пробі. B деяких випадках доцільне попереднє осадження білків з розчинів, наприклад трихлороцтовою кислотою або очищення білкових розчинів від низкомолекулярих компонентів шляхом діалізу або гель-фільтрації.

Щоб уникнути випадкових помилок, що можуть виникнути в процесі вимірювання, рекомендується готувати 3-5 повторів кожної проби.

При визначенні концентрації речовини в розчині слід визначати оптичну щільність досліджуваного розчину за калібрувальною кривою побудованою для даної сполуки.

Метод характеризується високою чутливістю 5 - 100 мкг білку/мл.

Метод Бредфорда - один з найбільш популярних колориметричних методів кількісного визначення білків в розчині. Запропонований біохіміком Бредфорд в 1976 року.

Метод заснований на реакції барвника кумасси (Coomassie Brilliant Blue G - 250) з аргініном і гідрофобними амінокислотними залишками. Утворена форма має блакитне забарвлення з максимумом поглинання при 595 нм і прямо пропорційна концентрації білку, що міститься в розчині.

Механізм зв'язування Coomassie полягає у взаємодії аніонної форми барвника з білком. Початковий кислий розчин Coomassie має максимум поглинання при довжині хвилі 465 нм. Після додавання до розчину білку аніонна форма барвника Coomassie взаємодіє з білком. В результаті зв'язування колір барвника з червонувато-коричневого стає блакитним. Зв'язування з білком здійснюється за рахунок електростатичної взаємодії сульфонільних груп барвника з амінокислотними залишками білку. Зв'язування Coomassie відбувається переважно з аргініновим залишком (Arg) і залишками гістидину (His), лізину (Lys), Тирозину (Tyr), триптофану (Trp) і фенілаланіну (Phe). В зв'язуванні барвника з білком приймають участь сили Вандер-Ваальса і гідрофобна взаємодія. Кількість зв'язків, що утворюються між Coomassie і білком, залежить від кількості позитивно заряджених груп, розташованих в молекулі білку.

Метод використовується для розчинів з низькою концентрацією білку. Чутливість методу залежить від співвідношення концентрацій визначуваного білку і барвника: чим більше барвника, тим чутливіший метод.

При постановці реакції Бредфорд використовують співвідношення об'єму реагенту до зразка рівне 50:1 (мінімально рекомендований об'єм відповідає 200 мкл реагенту і 4 мкл зразка). Вимір поглинання при 595 нм проводять в кюветі з довжиною оптичного шляху 1 мм.

Метод застосовується при концентрації білку в межах від 2 мкг/мл до 120 мкг/мл. У цих межах витримується лінійна залежність між величиною поглинання та концентрацією білку.

Побудова калібрувальної кривої.

Метод визначення концентрації білку по Брэдфорд, так само, як і метод Лоурі, вимагає побудови стандартної калібрувальної кривої перед виміром концентрації невідомого білку.

Для побудови калібрувальної кривої для методу Лоурі у флакон, який містить 5 мг ліофілізованого бичачого сироваткового альбуміну (БСА) або γ-глобуліну, обережно додають 5 мл фізіологічного розчину NaCl (концентрація маточного розчину 1мг/1мл). Потім легкими обертальними рухами перемішують до повного розчинення.

В окремих пробірках розводять маточний розчин для побудуви калібрувальної кривої як показано в таблиці (табл.7.1)

Таблиця 7.1

Схема розведення БСА для побудови калібрувальної кривої за