Хід роботи

Визначення концентрації білку в розчині з біуретовим реактивом. Діапазон вимірювань - від 5 до 100 г/л.

Біуретова реакція обумовлена наявністю в молекулі білків пептидних зв'язків, які у лужному середовищі утворюють комплексні сполуки з іонами Сu²⁺ з утворенням продукту фіолетового кольору, інтенсивність якого пропорційна вмісту білку в розчині.

Для визначення концентрації білку в невідомому розчині, за необхідності, готують розведення такого розчину і, згідно методики, вимірюють його ∆D.

Для досліду беруть три пробірки. У 1-шу (контрольну) пробірку вносять 0,1 мл 0,9% розчину NaCl, у 2-гу та 3-тю (дослідні) по 0,1 мл розчину білку невідомої концентрації. В усі три пробірки добавляють по 2 мл біуретового реактиву, обережно перемішують і через 30 хвилин визначають екстинкцію на ФЕК розчину 2-ої та 3-ої пробірки проти контролю (1-ша пробірка) вкюветі 5 мм при довжині хвилі 540 нм (зелений світлофільт).

Визначення концентрації білку з біуретовим реактивом в модифікації Ярош. Діапазон вимірювань - від 0,04 до 1,6 мг/мл.

В три пробірки приливають 2,4 мл розчину сечовини, в 1-шу пробірку додають 0,1 мл води (контроль), в 2-гу та 3-тю – по 0,1 мл розчину білків невідомої концентрації. Потім у всі пробірки додають 2,5 мл біуретового реактиву. Суміш старанно перемішують, інкубують в термостаті при 40⁰ С протягом 10 хвилин і охолоджують до 20⁰ С протягом 30 хвилин. Розчин колориметрують на ФЕК при довжині хвилі 540 нм в кюветі 5 мм проти контрольної проби (1-ша пробірка). Концентрацію білку в г/л визначають за калібрувальною кривою.

Завдання для виконання

1. Приготувати стандартний розчин альбуміну для побудови калібрувального графіка. З стандартного розчину альбуміну з концентрацією 100 мг/мл приготувати робочі розчини (для кожної концентрації готують не менш 3 визначень).

2. Виміряти оптичну густину розчинів починаючи з найменшої за допомогою біуретової реакції проти контрольної проби, що містить замість розчину білку фізіологічний розчин. Побудувати калібрувальну криву.

3. Кожна бригада одержує у лаборанта розчин білку невідомої концентрації.

4. Для визначення концентрацію білку в невідому розчині необхідно:

а) приготувати 3 різних розведення білку (в 2, 4, 6 разів або 2, 5, 10 разів);

б) виміряти об'єм розчину кожного розведення;

в) визначити концентрацію білку в кожному розведенні біуретовим методом і біуретовим методом у модифікації Ярош;

г) визначити кількість білку в мг для кожного розведення.

5. Порівняти значення одержані біуретовим методом і біуретовим методом у модифікації Ярош.

6. Написати висновок.

Контрольні запитання

1. Що таке світло.

2. Діапазони видимого, ультрафіолетового та інфрачервоного випромінення.

3. Основний закон фотометричних методів аналізу.

4. Принцип роботи фотоколориметра і спектрофотометра.

5. В чому принципова відмінність фотоколориметра і спектрофотометра

6. Чому в фотоколориметрах і спектрофотометрах встановлюють 1 джерело випромінювання.

7. З якою метою встановлюються світлофільтри в фотоколориметрах.

8. Як правильно вибрати світлофільтр для фотоколориметра.

9. З чого виготовляють кювети для вимірювання.

10. Що таке розчин порівняння.

11. Метод визначення концентрації білку з біуретовим реактивом.

12. Метод визначення концентрації білку з біуретовим реактивом в модифікації Ярош.

13. Побудова калібрувальних кривих.