Завдання для виконання

1. Приготувати стандартний розчин альбуміну з концентрацією 100 мг/мл та приготувати з цього розчину робочі розчини (кожну концентрацію зробити в 3 повторах).

2. Виміряти оптичну густину в кожній пробірці проти контрольної проби за методом Лоурі та методом Бредфорда. Побудувати калібрувальну криву.

3. Кожна бригада одержує у лаборанта розчин білку невідомої концентрації.

4. Для визначення концентрацію білку в невідому розчині необхідно:

а) приготувати 3 різних розведення білку (в 5, 10, 20 разів);

б) виміряти об'єм розчину кожного розведення;

в) визначити концентрацію білку в кожному розведенні методом Лоурі та методом Бредфорда;

г) визначити кількість білку в мг для кожного розведення.

5. Порівняти значення одержані методом Лоурі та методом Бредфорда.

6. Написати висновок.

Контрольні запитання

1. Принцип методу визначення концентрації білку методом Лоурі.

2. Принцип методу визначення концентрації білку методом Бредфорда.

3. Як будується калібрувальна крива.

4. На чому засновано визначення концентрації розчинів за допомогою фотометричних методів аналізу?

5. Які фотометричні методи визначення концентрації забарвлених розчинів ви знаєте?

6. Який з вивчених методів є самим чутливим.

Рекомендована література

1. Пентин, Ю.А. Основы молекулярной спектроскопии/ Ю.А.Пентин. - М.: Мир, 2008.- 398 с.

2. Шмидт, В. Оптическая спектроскопия для химиков и биологов / В. Шмидт.- М.: Техносфера, 2007. - 368 с.

3. Нельсон, Д. Основы биохимии Ленинджера. В 3 т. / Д. Нельсон, М. Кокс. - М.: Бином. Лаборатория знаний, 2012. - 694 с.

4. Lowry, O.H., Rosebrough N.J., Farr A. L., Randall R.J. Рrotein measurement with the folin phenol reagent. - J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - Р. 265-275.

5. Bradford, M. M. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.- Analytical Biochemistry. - 1976. - V.72. - P.248–254

Лабораторна робота 8

ВИЗНАЧЕННЯ ВМІСТУ ЦИТОХРОМІВ Р₄₅₀ ТА b₅ В МІКРОСОМАЛЬНІЙ ФРАКЦІЇ ПЕЧІНКИ ЩУРІВ ЗА ЇХ СПЕКТРАМИ ПОГЛИНАННЯ

Мета роботи: навчитися визначати вміст ферментного білку в очищеному білковому препараті за спектрами поглинання.

План

1. Аналіз білків in vitro.

2. Біохімічні методи дослідження білків.

3. Методи генної інженерії.

4. Ферменти. Роль атомів металу в роботі ферментного білку

5. Цитохроми.

6. Питома і молекулярна активність білків.

Матеріали та обладнання

Калькулятор, лінійка, олівець.

Загальні відомості

Для здійснення аналізу білків in vitro, необхідна їх очистка від клітинних компонентів. Цей процес зазвичай починається з лізису клітин, за допомогою різних методів, як наприклад ультразвукова дезінтеграція при певних умовах або ручним гомогенізатором, при якому клітинна мембрана руйнується і внутрішній вміст клітини вивільняється у буферний розчин. Далі клітинний екстракт очищують центрифугуванням, яке фракціонує різні клітинні компоненти у фракції, що містять розчинні білки, мембранні ліпіди й білки, клітинні органели і мікросомальну фракцію.

Біохімічні методи дослідження білків. Для вивчення біохімічної активності ферментних білків використовуються численні біохімічні методи, що мають загальну назву дослідження ферментативної активності. Ці методи в більшості випадків проводяться in vitro і ставлять за мету вимірювання кількості перетвореного субстрату або кількості утворених продуктів реакції. Безперервні процеси зазвичай залучають використання оптичних методів, таких як зміна оптичної щільності розчину або його флюоресценції, якщо відомі оптичні властивості субстратів або продуктів реакції, або вимірювання виділеного тепла при реакції. Часто застосовуються хроматографічні  або  радіографічні  методи. Хроматографічні методи (наприклад,  гелевий електрофорез, високоефективна рідинна хроматографія) використовуються для розділення продуктів реакції. Радіографічні методи використовують радіоактивні маркери одного з атомів у субстраті, замінюючи його на радіоактивний ізотоп, що легко визначається за допомогою фотографічних методів, чутливих до радіонуклідів.

Перевагою методів in vitro зазвичай є можливість виділити один або кілька компонентів, що досліджуються, та визначити їх активність.

Методи генної інженерії. За допомогою методів генної інженерії (направленого мутаганезу) дослідники можуть змінити амінокислотну послідовність білка таким чином, що його структура, клітинна локалізація і сприйнятливість до регулювання змінюються. Таким чином можна досліджувати вплив таких змін на функціонування всієї клітини, визначаючи природну роль білка , його функцію.

Поширеним застосуванням методу є повне усунення гену, що кодує даний білок, і дослідження впливу відсутності гену на клітину. Часто, коли білок, що відповідає за певну функцію, невідомий, проводиться так званий генетичний скринінг, коли за допомогою транспозонів, що вставляються до геному у випадкових місцях, можна отримати  мутантів  із відповідним фенотипом, а потім знайти положення транспозону, яке викликало мутацію. Встановлені таким чином білки часто називаються за назвою мутантного фенотипу, що спостерігається.

Ферменти це специфічні білки, що виконують в організмі роль біологічних каталізаторів, вони містяться в усіх клітинах організму.

Зміна кількості ферментів в клітині свідчить про ушкоджуючу роль якого-небудь чинника на клітини органу. Клітинні ферменти залежно від локалізації в тканинах ділять на дві групи:

- неспецифічні ферменти, які каталізують загальні для усіх тканин реакції обміну і знаходяться у більшості органів і тканин;

- органоспецифічні ферменти, властиві тільки для певного типу клітин і органів.

Екскреторні ферменти утворюються органами травної системи підшлунковою залозою, слизовою оболонкою кишечника, печінкою, ендотелієм жовчних шляхів. До них відносяться а-амилаза, ліпаза, лужна фосфатаза, цитохроми печінки та ін. В нормі їх активність постійна. При патології, коли блокований будь-який із звичайних шляхів екскреції, активність цих ферментів може збільшуватися або зменшуватися при дії речовин, що інгібують їх функцію.

Вимірювана активність ферментів може бути обумовлена наявністю дуже близьких за властивостями молекулярних форм ферментів, що відрізняються один від одного. Ці різні форми дістали назву ізоферментів.

Однією з найбільш характерних властивостей ферментів є їх висока субстратна специфічність. Це означає, що фермент діє чітко тільки на одну речовину (абсолютна специфічність) або на невелику кількість близьких за будовою речовин, що мають однакову функціональну групу з якою і взаємодіє фермент (широка субстратна специфічність). Ступінь специфічності може значно змінюватися у різних ферментів.

Вивчення специфічності ферментних білків дозволило встановити, що субстрат зєднується не зі всією молекулою фермента, а з її окремою частиною, яка називається активним центром фермента. Реакція, яку каталізує фермент протікає в активниму центрі.

Ферментні білки, до складу активного центру яких входять атоми металів називаються металоферментами. Іони металів в такому білку утворюють різного типу комплексні сполуки як з ферментним білком, так і з субстратом.

До складу ферментних білків можуть входити катіони: Nа⁺, K⁺, Rb⁺, Cs⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Zn²⁺, Cd²⁺, Cr³⁺, Cu²⁺, Mn²⁺, Fe²⁺, Co²⁺, Ni²⁺ та Al³⁺ - всього біля 15 металів.

Роль атомів металу в роботі ферментного білку:

– метал є одним з компонентів каталітичного центру;

– атоми металу створюють або стабілізують просторову конформацію активного центру;

– атом металу активує ферментний білок;

– катіон металу повязує активний центр ферменту з молекулою субстрату.

Білок і метал виявляють взаємний вплив. Наявність іону металу в молекулі ферменту впливає на електронний та структурний стан білку і, таким чином, змінює його властивості. З іншого боку, білок створює для металу незвичну стереохімічну просторову будову, що в свою чергу впливає на властивості металу. Біологічна функція деяких металів полягає в запасанні відповідних іонів металів. Такі білки як кональбумін яєчного білку, трансферин плазми крові, зворотно звязують і переносять іони заліза, церулоплазмін переносить іони міді. Є білки, які контролюють концентрацію в організмі іонів кальцію, магнію, цинку на інших металів.

Атоми перехідних металів входять до складу ферментних білків, які беруть участь в ряді біологічних окисно-відновних процесів, задіяні в ферментних системах, що виконують функцію зберігання та транспорту кисню. Найбільш важливими є такі метали як залізо, мідь і кобальт, в меншій мірі, молібден. В реакціях окисно-відновні перетворення іонів металу лежать в основі певних каталітичних процесів, повязані з переносом електронів, окисненням або відновленням субстратів.

Серед металоферментів залізовміщуючі ферментні білки (гемопротеїни) є особливо важливими для біологічних процесів.

Представники цього класу відповідальні за транспорт та зберігання кисню (гемоглобін, міоглобін), перенесення електронів (цитохроми), каталіз окисно-відновних реакцій (оксидази та пероксидази), каталіз розкладення пероксиду водню (каталази).

Залізо входить до складу багатьох ферментних білків - гемоглобіну, цитохромів, пероксидаз, каталаз. Деякі ферменти переносять атоми заліза (ферритин), інші - контролюють його концентрацію (трансферин).

Гемоглобін - це глобулярний білок здатний зв'язувати і переносити молекулярний кисень. Гемоглобін є основним компонентом еритроцитів. У одному еритроциті міститься близько 280 мільйонів молекул гемоглобіну, кожна з яких складається приблизно з 10 тисяч атомів водню, вуглецю, азоту, кисню, сірки і заліза.

Гемоглобін - представник гемопротеїнів. Молекулярна вага гемоглобіну дорівнює 68000. Основна функція гемоглобіну - зворотне зв'язування молекулярного кисню і доставка його в усі клітини організму.

Молекула гемоглобіну складається з чотирьох субодиниць - двох α і двох β субодиниць. Поліпептидний ланцюг кожної з субодиниць специфічним чином укладений навколо великого плоского залізовмісного гема. Усі чотири ланцюги гемоглобіну схожі між собою за формою.

Гем тільки у складі з нативним глобіном здатний лабільно зв'язувати кисень. При поглинанні кисню β-ланцюги гемоглобіну зближуються, при віддачі - розходяться. Положення α-ланцюгів при цьому не міняється. Отже, приєднання і віддача кисню молекулою гемоглобіну супроводжується зміною його структури, що призводить до зміни спектру поглинання гемоглобіну.

Приєднавши молекулу кисню, гемоглобін переходить в оксигеновану форму.

До поширених похідних гемоглобіну відносяться також метгемоглобін і карбоксигемоглобін. У метгемоглобіні залізо знаходиться в тривалентному стані, тоді як в деоксигенированном і в оксигенированном гемоглобіні - в двовалентному. Метгемоглобін утворюється при витримці на повітрі розчинів оксигемоглобіну.

Кожна форма гемоглобіну має спектр поглинання, що характеризується властивою йому залежністю оптичної густини розчину від поглинання при певній довжині хвилі. Найбільш інтенсивною смугою в спектрі поглинання гемоглобіну є смуга Соре, що належить порфириновій частині його молекули.

Спектр поглинання гемоглобіну характеризує інтенсивна Соре в районі 400 нм, а також інші інтенсивні смуги поглинань між 500 і 600 нм, які позначаються як α- і β-смуги (рис. 8.1).

Гемоглобін має велику спорідненість до чадного газу (СО), переходячи при взаємодії з ним в карбоксигемоглобін, що не має здатності оборотно приєднувати кисень. У основі отруєння людейугарным газом лежить освіта в їх крові значних кількостей карбоксигемоглобіну, що призводить до гіпоксії організму.

Форма і функція гемоглобінів різних організмів схожі, але амінокислотний склад їх відрізняється тим сильніше, чим більше організми еволюційно віддалені один від одного.

Цитохроми є особливо важливими для біологічних процесів серед металоферментів залізовміщуючих ферментних білків. Термін «цитохром» означає (cito -клітина; сhromos -колір) «клітинні пігменти». В природі відомо 25-30 різних цитохромів. Всі вони позначаються буквами a, b, c, P і т.д.

Представники цього класу відповідальні за транспорт та зберігання кисню (гемоглобін, міоглобін), перенесення електронів (цитохроми), каталіз окисно-відновних реакцій (оксидази та пероксидази), каталіз розкладення пероксиду водню (каталази). Ізоформи цитохрому Р-450 локалізовані в різних органах та тканинах організму, але найбільша концентрація цих білків знаходиться в гепатоцитах печінки (клітини печінки).

величина

поглинання

довжина хвилі, нм

Рис. 8.1. Спектр поглинання гемоглобіну та оксигемоглобіну

Відомо, що білки діляться на прості (при гідролізі утворюють тільки амінокислоти) та складні (при гідролізі утворюють, крім амінокислот, органічні або неорганічні сполуки). Небілкова частина складного білку називається простетичною групою. Цитохроми мають простетичну групу, у складі якої є атоми заліза (гемовий білок). Простетична група, що міститься атом заліза, називається гемом, а білки, що мають гем - гемовими (рис. 8.2).

N

О₂

Рис. 8.2. Будова гема

Простетична група гемоглобіну це молекула протопорферину з гемом заліза (рис.8.3, В). Атом Fe²⁺ утворює два ковалентні та два координаційні зв'язки з атомами азоту пірольних кілець протопорфирину (рис. 8.3, Б). Залізо Fe²⁺ легко віддає електрони і переходить в окиснений стан:

Fe⁺²-е^- ↔Fe⁺³

відновлений стан окиснений стан

При віддачі електронів залізо окиснюється, при приєднання - відновлюється.

Порфирин - циклічна структура, що складається з чотирьох пірольних кілець, пов'язаних між собою метановими містками (рис.8.3, А).

Протопорфирин (рис.8.3, Б) має чотири метильных, два вінільних радикала та два залишки пропіонової кислоти.

Цитохроми відіграють важливу роль в метаболізмі ксенобіотиків в організмі людини (метаболізують біля 60% лікарських речовин), здійснюють реакції окиснення молекулярним киснем органічних сполук і є важливим елементом системи детоксикації ксенобіотиків. Локалізовані, в основному, в мембранах, а в еукаріотів (рослини та тварини) - в мітохондріальних мембранах та ендоплазматичному ретикулумі.

Рис. 8.3. Будова молекули: А - порфирину, Б - протопорфирину і В - гемоглобіну (протопорфирин з гемом заліза)

Цитохром Р₄₅₀. Система цитохрому Р₄₅₀ відноситься до однієї з найдревніших ферментних систем і виявлена у усіх прокаріотів і еукаріотів. Ізоформи цитохрому Р₄₅₀ локалізовані в різних органах і тканинах організму.

Цитохром Р₄₅₀ має широку субстратну специфічність, утворює свою ізоформу для кожного субстрату. Сімя ізоформ цитохрому Р₄₅₀ бере участь в великій кількості реакцій.

Основна роль системи цитохрома Р₄₅₀ в клітинах організму − метаболізм ендогенних сполук та ксенобіотиків. Його субстратами можуть бути нормальні клітинні компоненти, метаболіти внутрішньоклітинних реакцій та ксенобіотики, що не є компонентами клітин живих організмів. Це можуть бути хімічні сполуки, що надходять ззовні, лікарські засоби. Цитохром Р₄₅₀ приймає участь в детоксикації цих сполук, тобто під дією цитохрому Р₄₅₀ ксенобіотики перетворюються в продукти, що швидко виводяться з організму. Цитохроми класифікують за їх спектрами поглинання в області довжин хвиль між 400 і 600 нм. Індивідуальний спектр цитохрому Р₄₅₀ має максимум при довжині хвилі 450 нм.

Цитохром b₅ є одним з компонентів системи цитохрому Р₄₅₀. Цитохром b5 є гемопротеїном, має гемову групп. Фермент бере участь в разноманітних біохімічних окисно-відновних реакціях як переносник електронів, локалізований в еритроцитах та цитозолі, присутній в різних клітинах організму. Це мембранний білок, що входить до складу білків ендоплазматичних мембран. Має 93 амінокислотних залишки і одну гемову групу, що повязана з білком двома гістидиновими залишками. Відомі ізоформи цитохрому b₅ можна разділити на 2 групи - розчинні та мембранопов'язані. Індивідуальний спектр цитохрому b₅ має два характерні поглинання: mіn при довжині хвилі 410 нм і max при довжині хвилі 425 нм.

В природі відомо 25-30 різних цитохромів.

Гепатоцити - клітини печінки людини і тварин. Складають від 60% до 80% маси печінки. Ці клітини беруть участь в синтезі і зберіганні білків, трансформації вуглеводів, синтезі холестерину, жовчних солей і фосфоліпідів, детоксифікації, модифікації і виведенні з організму ендогенних субстанцій. Також гепатоцити ініціюють процес утворення жовчі.

Гепатоцити мають інтенсивний і високоспеціалізований клітинний метаболізмом, містять багато специфічних ферментів.

Якщо йде мова про ушкодження печінки, то мається на увазі саме ушкодження гепатоцитів і синтезу ферментів, які вони містять.

Багато ферментів печінки, що синтезуються в гепатоцитах, виділяються в кров'яне русло і функционирують по всьому організму. Деякі ферменти і ферментні системи гепатоцитів печінки міцно пов'язані з клітинною мембраною і мужуть визначаться тільки після руйнування клітини.

Активність цитохромів, як і всіх ферментів проявляється за швидкістю каталізованої ними реакції при певній температурі, рН середовища та концентрації субстрату. Тому при визначенні активності ферментів необхідно суворо дотримуватися певних умов. Такі ж умови повинні дотримуватися і при виділенні і очищенні ферментів.

Питома і молекулярна активність білків. Активність білку, що відноситься до одиниці маси білку називається питомою, а активність білку розрахована на молекулу – молекулярною.

Питома активність білків виражається частіше всього в мікромолях або в наномолях субстрату перетвореного за 1 хвилину 1 мг фермента.

Молекулярна активність білків виражається числом молекул субстрату, перетворених за одну хвилину однією молекулою ферменту або числом молекул субстрату, перетворених за одну хвилину одиним активним центром.

Кількість речовини. Одиниця кількості речовини. Кількість речовини визначається числом структурних одиниць (атомів, молекул, іонів або інших частинок) цієї речовини. Для вимірюваний кількості речовини в хімії використовують одиницю, що носить назву моль.

Моль – це кількість речовини, що містить стільки структур­них одиниць (молекул, атомів, іонів тощо), скільки атомів містить 12 г вуглецю .

1 М це концентрація речовини, що дорівнює концентрації 1 моль/л.

Кількість структурних одиниць (молекул, атомів, іонів, елек­тронів), що містить один моль речовини, дорівнює N = 6,02·1023. Ця величина носить назву числа Авогадро.

1 г-моль це кількість г речовини, що чисельно дорівнює її молекулярній масі. Молярна маса - це маса одного моля речовини, тобто така її кількість, в якій міститься стільки ж атомів, скільки в 12 г вуглецю. По-іншому, така кількість називається числом (або постійною) Авогадро. Відповідно до неї в рівних об’ємах ідеальних газів (при однакових температурі і тиску) повинно міститися однакове число молекул.

Молярну масу вимірюють у грам - моль (г-моль). Чисельно вона дорівнює молекулярній (або атомній) масі речовини.

Молекулярна маса речовини дорівнює сумі атомних мас елементів, що входять до складу молекули.

1 моль = 103 ммоль або mmol 1 моль = 106 мкмоль або μmol 1 моль = 1012 наномоль або nmol

1 мілімоль = 10-3 моль 1 мікромоль = 10-6 моль 1 наномоль = 10-9 моль

Визначення активності або вмісту ферментного білку проводиться методами спектрофотометрії. Спектри поглинання білків різної природи суттєво відрізняються між собою. Для біологічних молекул характерні широкі смуги поглинання, обумовлені електронними, коливальними і обертальними рівнями. Властивість атомів і молекул поглинати світло з певною довжиною хвилі, характерною для цих білків, широко використовується для якісних і кількісних досліджень їх складу та активності.

Молекулярні групи, що містяться у ферментних білках і активно поглинають світло, називаються хромофорами.

При проходженні через розчин речовини світло поглинається. Згідно із законом Бугера-Ламберта-Бера. Якщо інтенсивність падаючого потоку позначити як I_o, а інтенсивність світлового потоку, що пройшов через розчин білку як I, то відношення I/I_o називають величиною пропускання, а логарифм цього відношення є величиною поглинання.

I

А= lg T = lg ---- =  ∙ l ∙ C,

I_o

де А - поглинання речовини, або оптична густина. Для абсолютно прозорого розчину А = 0, для абсолютно непрозорого – А ^ .

Т - пропускання зразка, тобто відношення інтенсивності світла того, що пройшло через зразок, до інтенсивності світла, що падає;

I/I_о - молярна поглинальна здатність речовини;

C - концентрація речовини (моль/л);

l – товщина світлопоглинаючого шару (товщина кювети), см;

- молярний коефіцієнт поглинання або екстинкції білку дорівнює оптичній щільності одномолярного розчину цього білку в кюветі з товщиною поглинаючого шару 1 см. Це індивідуальна характеристика речовини, він залежить від природи речовини і поглинає світло певної довжини хвилі.

З формули видно, що за експериментально визначеною величиною поглинання при певній довжині хвилі, можна визначити концентрацію речовини якщо відомий молярний коефіцієнт поглинання ε для цієї речовини.

Білки можуть поглинати світло у видимій (400-700 нм) або ультрафіолетовій (200-400 нм) областях спектра. Більшість білків мають максимум поглинання при довжині хвилі 280 нм, що обумовлюється вмістом в них залишків триптофану та тирозину. Нуклеїнові кислоти також частково поглинають світло при довжині хвилі 280 нм.

Часто білки мають характерний спектр поглинання. Для цитохрому Р₄₅₀ це поглинання при 450 нм (max), для цитохрому b₅ - при 409 нм (min) та при 428 нм (max), що дає змогу визначити їх вміст в білковій суміші.

Визначення залежності концентрації поглинаючої речовини від величини поглинання при певній довжині хвилі проводиться за методами спектроскопії. Для реєстрації спектрів поглинання використовуються спектрофотометри.

Найчастіше використовувані спектрофотометри мають діапазон вимірів по довжинах хвиль 180-1100 нм. Цей діапазон включає три області спектру : ближню ультрафіолетову область(УФ) - 180-380 нм; видиму - 380-760 нм і ближню інфрачервону(ГИК) - 760-1100 нм.

Область вимірювання спектрупоглинання конкретного білку визначається виходячи з його властивостей.

Основне рівняння квантової теорії випромінення та поглинання:

Е = Е₂ – Е₁ = h ,

де Е₁ та Е₂ – енергія двох квантових рівнів, між якими здійснюється перехід;

h - стала Планка, постійна величина;

 - число довжин хвиль енергії, що випромінюється або поглинається.

За допомогою закону Ламберта-Бера можна встановити звязок між величиною поглинанням і природою білку, що поглинає.

Згідно цього закону

I₀

D = lg ------- =   c  l  конц. загального білку

I

де: I₀ – інтенсивність світового пучка, що падає на розчин білку;

I - інтенсивність світового пучка, що виходить після розчину білку;

D - величина поглинання білку при певній довжині хвилі, визначається за графіком;

c – концентрація білку, що зумовлює даний спектр поглинання, моль/л;

 - коефіцієнт молярної екстинкції або молярний коефіцієнт поглинання – це поглинання 1 М (одномолярного) розчину даного білку;

l – товщина поглинаючого шару, см. У випадку роботи на спектрофотометрі це товщина кювети, в якій знаходиться розчин (l =1 см);

 - молярний коефіцієнт поглинання, (М^-1٠см^-1), величина приводиться в таблицях.

З формули (1) витікає, що

 D

с = ------------------------- = А моль/г _білку або мілімоль/мг _білку

  l  конц.білку

де D = I – I₀ поглинання білкового розчину, вимірюється для цит. b₅ та цит. Р₄₅₀ по їх спектру поглинання приведеному в індивідуальному завданні;

 - коефіциєнт молярної екстинкції для цит. b₅ і цит. Р₄₅₀ див. табл. 8.1;

l = 1 см;

концентрацію білку мг/мл вираховуємо за об'ємом реакційної суміші та концентрацією білку мікросомальної фракції (приведена в індивідуальному завданні). Наприклад:

Vреакційної суміші = Vбуфера + Vфракції мікросом =

= 7,2 мл + 0,2 мл = 7,4 мл

Концентрація білку фракції мікросом = 18,4 мг/мл.

Отже, 18,4 мг білку міститься в 1 мл розчину білку, а

х мг білку - в 0,2 мл цього розчину,

18,4 ∙ 0,2

звідси х = ------------ = 3,68 мг

1

3,68 мг білку міститься в 7,4 мл (Vреакційної суміші), а

у мг білку - в 1 мл,

3,68 ∙ 1

звідси у = --------- = 0,497 мг/мл

7,4

Перевірка формули за одиницями розмірності:

1 М  см  мл мілімоль  мл мілімоль

с = -------------------------------- = ---------------- = ------------------- = -------------

М^-1 см^-1 см  мг_білку/мл см  мг_білку мл  мг_білку мг_білку

Таблиця 8.1