4. Адсорбційні методи розділення і очистки ферментів

Ферменти та інші білки мають здатність адсорбуватись на нерозчинних сполуках. Ця їх властивість і використовується в практиці розділення суміші білків і очистки ферментів. Адсорбційні методи дозволяють отримати ферменти найвищого ступеню очистки з високим виходом цільового продукту.

Поширеними адсорбентами білків є різні іонообмінники: гелі фосфату калію, гелі гідроксиду алюмінію і різні аффінні адсорбенти, які підбирають або створюють для певного ферменту. Аффінатом (лігандом) називають групу атомів, здатних виділити на вільні орбіти катіону металу два електрона, внаслідок чого здійснюються умови утворення координаційного зв'язку. Найбільша складність - знайти ліганд, який зміг би "пізнати" потрібний фермент і "зняти" його з сорбенту.

Незалежно від того, на чому базується розділення білків - на адсорбції, іонному обміні, іммобілізації на носієві - ліганді чи на ефектах молекулярного сита - техніка їх розділення майже однакова і полягає в наступному. Суміш білків та інших сполук, яку треба розділити, розчиняють у відповідному розчиннику (буфері) і вносять в адсорбційну колонку попередньо заповнену цим же розчинником. Потім через колонку пропускають буфер певного складу або вилучають фермент методом градієнтової елюції. Елюат, що виходить із колонки, збирають по фракціям, які служать вихідним матеріалом для отримання того чи іншого ферменту.

Можна затримувати певний білок (фермент) за допомогою специфічного для нього ліганду. Ліганд треба з'єднати з якоюсь матрицею так, щоб був вільний підхід ферменту до нього. Після закріплення на ліганді специфічного ферменту останній вимивають, а колонку з сорбентом регенерують.

5. Іммобілізовані ферменти

При застосуванні ФП дуже часто ферменти інактивуються, виводяться з оброблюваним матеріалом і забруднюють його. Тому постала задача розробки нових методів застосування ФП багаторазового використання шляхом їх закріплення на нерозчинній основі. Такі ферменти в літературі називають по різному: зв'язаними, пришитими, фіксованими, прикріпленими, але найчастіше їх називають іммобілізованими. Іммобілізований ФП - це єдина система, яка складається із трьох елементів: фермента, носія і зв'язуючої їх ланки.

Всі носії ділять на дві групи: органічні полімерні і неорганічні. Органічні полімерні носії бувають природні (полісахаридні і білкові) та синтетичні (поліметиленові, поліамідні і поліефірні). До групи неорганічних носіїв входять: синтетичні кремнеземельні сорбенти, метали та їх окисли, різні види глин, кераміки і природні мінерали.

До носіїв пред'являють певні вимоги: вони повинні бути нерозчинними в реакційному середовищі, мати різний заряд з ферментом, мати високу гідрофільність, хімічну і біологічну стійкість, механічну міцність, легко гранулюватися і активуватися. Носії можуть мати зернисту структуру, бути у вигляді волокон, плівок, полих трубок, мембран.

Всі способи іммобілізації можна розділити на дві великі групи: хімічні і фізичні, тобто з утворенням ковалентних зв'язків або без них.

До хімічних способів слід віднести іммобілізацію ферментів шляхом ковалентного зшивання з полімером і поперечного зшивання ковалентними зв'язками молекул білків без носія. Хімічні способи є основними при отриманні іммобілізованих ФП. Такі препарати стабільні, ферменти не вимиваються. Суттєвим недоліком цих способів є значна інактивація ферментів.

Фізичні методи закріплення ферментів діляться на адсорбційні і механічні. При адсорбційній іммобілізації фермент утримується на поверхні носія за допомогою електростатичних, гідрофобних і водневих зв'язків, а також завдяки дисперсійним взаємодіям. При механічному способі іммобілізації відбувається включення фермента в гелі, мікрокапсули, волокна, мембрани тощо. Всі фізичні методи досить прості та ефективні і широко застосовуються в інженерній ензимології.

Одним із перспективних фізичних способів є заключення ФП в напівпроникливу оболонку-капсулу (мікрокапсулювання). Мікрокапсули - це дуже мілкі часточки покриті полімерною оболонкою, всередині яких знаходиться фермент. Мікрокапсулювання дає можливість багаторазово використати ферменти і виключає контакт працюючих з ними. Але складність цього процесу полягає в тому, що фермент не повинен вимиватись через пори плівки, а субстрат і продукти його розщеплення - вільно проходити через них. Більш широко, ніж мікрокапсулювання, використовують метод гранулювання ФП, особливо тих, що приміняють як компоненти синтетичних миючих засобів.

Останнім часом велика увага приділяється іммобілізації клітин мікроорганізмів і використанню цих систем для проведення ферментативних реакцій. Цей спосіб особливо ефективний, коли йдеться про внутрішньоклітинні ферменти.