2. Осадження ферментів органічними розчинниками і солями

Виділення ферментів із складної суміші речовин представляє значні труднощі, оскільки для агрегації білкових молекул і випадання їх в осад слід чітко дотримуватись певних умов.

Розчинність білків в різних розчинниках визначається розподілом на поверхні їх молекул гідрофобних і гідрофільних груп. Змінюючи деякі властивості води як основного розчинника білків, можна створити певне оточення білкових молекул, вплинути на їх гідратний або сольватний шар і викликати агрегацію молекул та випадання їх в осад. В промисловості осаджують ферменти з використанням органічних розчинників і солей.

Молекули води, що розміщені на гідрофобних ділянках поверхні білка, можуть бути замінені молекулами органічного розчинника. При цьому розчинність білків знижується і вони осаджуються.

При виборі розчинника треба враховувати його можливу токсичність, вибухонебезпечність і можливість його регенерації. Придатними є етанол, ізопропанол і рідше - ацетон.

Процеси агрегації залежать від природи органічного розчинника і багатьох інших факторів:

• великі молекули агрегують швидше, ніж малі;

• при осадженні ферментів температура має бути якомога нижчою (тому етанол перед внесенням в розчин охолоджують на 5-10°С);

• найбільш повно і швидко ферменти випадають в осад в ізоелектричній точці;

• максимальний вихід ферментів отримують при осадженні їх із розчинів, що містять не більше 10-12 % СР;

• тривалість контакту ферментів з розчинником має бути мінімальною.

Відомо, що іони солей гідратуються і якщо добавити значну їх кількість в розчин, відбувається зв'язування ними води. Внаслідок дегідратації неполярних ділянок білкових молекул, останні взаємодіють одна з одною, утворюють агрегати; розчинність білків різко падає і вони випадають в осад. Хоча висолювання білків в основному визначається гідрофобними взаємодіями, на цей процес суттєво впливають і інші фактори: рН середовища (його близьке значення до ізоелектричної точки білку), температура, ступінь чистоти ферментного розчину, тривалість процесу та ін.

Для осадження використовують сульфат амонію, сульфат натрію, сульфат цинку і хлористий натрій. Застосовують також декстрини, поліетиленгліколь, заряджені полімери, іони деяких металів. Найкраще осадження білків відбувається при концентрації солі, що близька до концентрації насичення.

Самими складними стадіями процесу є внесення солей і їх розчинення. Солі подрібнюють і добавляють невеликими порціями при постійному перемішуванні, щоб запобігти утворенню локальних зон підвищеної концентрації солі в розчині. Процес формування осаду залежить від рН і температури середовища і може тривати від 20-40 хв. до кількох годин. При підвищеній температурі (20-30° С) процес агрегації молекул білку проходить швидше. Важливо, що при висолюванні можна досягти часткового фракціювання комплексу ферментів.

Вологі ферментні препарати направляють на сушіння (тоді отримують ФП з індексами Г10Х чи П10Х) або для одержання високоочищених ФП з використанням мембранних, адсорбційних та інших методів.

Сушіння ФП має метою отримати стабільний при зберіганні продукт із культуральної рідини, її концентрату чи з вологої пастоподібної маси, отриманої при осадженні ферментів органічними розчинниками і солями. Для обезводнення ферментних розчинів застосовують сушіння в вакуум-сушильних шафах (ВСШ), розпилювальних і сублімаційних установках. При висушуванні мають місце ряд труднощів, пов'язаних з термолабільністю ферментів.

В ВСШ висушують осади в тонкому шарі (не більше 5 мм) при температурі до +30°С і залишковому тиску не більше 136 Па. Тривалість -8-16 год., втрата активності ферментів - 6-10%.

Останнім часом спостерігається тенденція випускати стабільні рідкі ФП у вигляді упарених концентратів або використовувати для сушіння сублімаційні сушарки. В останніх процес ведуть при глибокому вакуумі. Матеріал на початкових стадіях віддає частину вологи, охолоджується і самозаморожується. Залишковий тиск становить 13-133 Па, температура препарату, що висушується спочатку становить мінус 20 - мінус 30°С. Коли вологість знижується до мінімуму, температуру піднімають до +30 - + 40°С.

Процес висушування ферментних осадів в сублімаційних сушарках включає три стадії: заморожування осаду, возгонка льоду і видалення залишкової вологи. В перший період видаляється 12-18% загальної кількості вологи, в другий - 50-65% і за останній вилучають решту вологи (до рівноважної, яка має становити 6-8%).В цих сушарках ферменти практично не інактивуються.

Про особливості режимів сушіння ФП в розпилювальних сушарках було сказано вище.