3.2 Хімічні методи дослідження фруктових соків

3.2.1.Ферментативне визначення вмісту сахарози.

Спектрометричний метод з використанням β-нікотинамід-аденін-динуклеотидфосфату.

Устаткування

1. Піпетки ферментні для досліджень, градуйовані лише вздовж стрижня з довгим неградуйованим наконечником.

2. Кварцеві, скляні або пластмасові кювети, з товщиною шару 10 мм, що не поглинає світло за робочої довжини хвиль (наприклад, 334 нм, 340 нм або 360 нм).

3. Фотометр з лінійчатим спектром освітлення, обладнаний ртутною лампою та фільтрами для вимірювання за довжини хвиль 334 та 365 нм.

4. Спектрофотометр (з довжиною хвилі, що настроюється) для вимірювання за довжини хвилі 340 нм (замість 3)

Познаки та абревіатура

АТФ-аденозин-5'-трифосфат;

АДФ- аденозин-5'-дифосфат;

НАДФ-β-нікотинамід-аденін-динуклеотидфосфат;

НАДФН- β-нікотинамід-аденін-динуклеотидфосфат (відновлена форма);

Г-б-Ф- глюкоз-6-фосфат;

ГК- гексокиназа;

Г6Ф-ДН- глюкоза-6-фосфат дегідрогеназа ;

БФ -β-фруктозіада;

ME -одна міжнародна одиниця ферментативної активності, що каталізує конверсію 1 мкмоль субстрату за хвилину за температури 25 °С; с- концентрація речовини;

Р- масова концентрація

Принцип методу

Сахароза підлягає ферментативному гідролізу (інверсії) під дією БФ у розчині зразка, що його випробовують, створюючи еквівалентну кількість D-глюкози i D-фруктози. Потім утворена D-глюкоза фосфорилюється в позиції С-6 в xoді каталізованї ферментом реакії, з участю АТФ та ГК.

У супутій реакції Г-6-Ф, у присутності НАДФН, стереохімічно конвертується у 6-фосфоглюконат. Дана реакція каталізуеться ферментом Г6Р-ДН, а кількість НАДФН, що утворюється, еквівалентна вмісту D-глюкози, що утворилась у зразку, який випробовували

Визначання кількості утвореного НАДФН, а звідси i вмісту D-глюкози та сахарози, проводять методом спектрометрії.

Хімізм методу:

Сахароза + Н₂О →^БФ D-глюкоза + D-фруктоза

Глюкоза +АТФ→^ГК Г-6-Ф +АТФ

Г-6-Ф +НАДФ→^Г6Ф-ДН 6-фосфоглюконат + НАДФН + Н⁺

Готування проби для випробовування

Фруктовий ciк необхідно розбавити так, щоб концентрація сахарози/глюкози становила від 0,1 г/л до 1,5 г/л. Цей розчин треба використовувати негайно, i він не потребує попереднього обробляння. Результати розраховують на об'єм проби i виражають в розрахунку на 1 л зразка. Аналіз концентрованих продуктів теж можна виконувати в розрахунку на об'єм проби після її роз­бавлення до відомої відносної густини. В цьому випадку відносну густину необхідно вказати. Знаючи масу проби та враховуючи фактор розбавлення, результати можна виразити i в мг/кг про­дукту. У продуктах з високою в'язкістю i (або) дуже високим вмістом м'якості (наприклад, м'язга) подання результатів в розрахунку на масу проби є звичайною процедурою.

Перед розбавленням каламутні зразки добре перемішують. Цi або сильно забарвлені зразки, можливо, потрібно буде розбавити більше, ніж того вимагає вміст сахарози. Освітлюють каламутні зразки, що містять дуже низькі концентрації сахарози, за допомогою попереднього центрифугування або мембранної фільтрації крізь фільтр з розміром пор 0,2 мкм.

Хід випробовування

Випробовування необхідно проводити за постійної температури від 20 °С до 25 °С .

До цього методу рекомендовано додавати сахарозу у вигляді стандартного розчину.

Контрольний розчин для визначення сахарози

Вводять піпеткою в кювети 0,20 мл цитратного буферного розчину i 0,02 мл розчину БФ. Перемішують i через 15 хв додають 1,00 мл буферного розчину триетаноламіну; 1,70 мл води, 0,1 мл розчину НАДФ i 0,1 мл розчину АТФ. Перемішують i через 3 хв вимірюють поглинання (А₁) розчину по відношенню до повітря .

Контрольний розчин для визначання глюкози

Вводять піпеткою в кювети 1,00 мл буферного розчину; 1,92 мл води; 0,10 мл розчину НАДФ i 0,1 мл розчину АТФ. Перемішують i через 3 хв вимірюють поглинання (А₂) роз­чину по відношенню до повітря.

Розчин сахарози, яку випробовують

Вводять піпеткою в кювети 0,20 мл цитратного буферного розчину; 0,10 мл розчину зразка i 0,02 мл розчину BF. Змішують i через 15 хв додають 1,00 мл буферного розчину; 1,60 мл води; 0,1 мл розчину НАДФ i 0,10 мл розчину АТФ. Перемішують i через 3 хв вимірюють поглинання (А₃) розчину по відношенню до повітря .

Розчин глюкози, яку випробовують

Вводять піпеткою в кюветки 0,1 мл розчину зразка; 1,00 мл буферного розчину; 1,82 мл води; 0,10 мл розчину НАДФ i 0,1 мл розчину АТФ. Перемішують i через 3 хв вимірюють поглинання (А₄) розчину по відношенню до повітря .

Ферментативна реакція, визначання кількості сахарози

По кожному з попередніх розчинів окремо проводять наступну процедуру.

Додають 0,02 мл суспензії ферменту ГК/Г6Ф-ДН. Добре перемішують, чекають, поки реакція припиниться (10—15 хв.) i вимірюють поглинання розчнів (А₅, А₆, А₇, А₈).

Обчислювання результатів

Реакції, на яких базується даний метод визначання, свідчать про існування лінійної пропорції між кількістю сформованої НАДФН (а звідси різниця поглинання ∆А) i концентрацією сахарози.

∆А_{сахароза}=∆А_{загальна глюкоза}-∆А_{глюкоза}

∆А_{загальна глюкозка}=(А₈-А₃)_{р-н сахарози що випроб.}-(А₅-А₁)_{контрольний р-н для визн. сахарози}

∆А_{глюкоза}=(А₇-А₄)_{р-н глюкози що випроб.}-(А₆-А₂)_{контрольний р-н для визн. глюкози}

Розрахунок концентрації сахарози в розбавленому розчині за допомогою вимірювання світлопоглинання базується на законі Бера-Ламберта.

Вміст сахарози (р) у грамах на літр зразка обчислюють за такою формулою:

М — молекулярна маса сахарози (342,3 г/моль);

V, — загальний об'єм розчину в кюветі, мл;

V₂ — об'єм розчину випробного зразка, доданого в кювету, мл;

F — фактор розбавлення розчину зразка;

S — товщина кювети, см;

ε — коефіцієнт екстинкції НАДФН:

за 340 нм = 6,31 ммоль^-1см^-1;

за 365 нм = 3,51 ммоль^-1-см^-1;

за 334 нм = 6,181 ммоль^-1 см^-1.