де Sa — показник абсолютного виживання сперміїв; Σ — сума; а — оцінка сперміїв за рухливістю (активністю) в балах; t — час між по- передньою і наступною перевірками; n — кількість проведених до- сліджень.

Відносний показник виживання сперміїв — це відношення абсо- лютного показника їх виживання у розрідженій відповідно спермі до показника їх виживання у нерозрідженій спермі.

При застосуванні спрощеного методу оцінки виживання сперміїв шкалу розрідження сперми бугая можна обмежити шістьма пробір- ками (в 2, 4, 8, 16, 32 та 64 рази), а в барана — чотирма пробірками (в 2, 4, 8 та 16 разів) і рухливість сперміїв визначати лише 2 – 3 доби.

Іноді виживання сперміїв у розрідженій спермі перевіряють при- скореним методом — витримуванням їх у водяній бані при 38 ºС з щогодинним визначенням рухливості сперміїв.

При визначенні виживання деконсервованої сперми експрес- методом з кожного глибоко замороженого дуплетного еякуляту бе- руть по дві дози сперми і вмішують на інкубацію у термостат або в автоматичну водяну баню при температурі 38 ºС. Одночасно оціню- ють вихідну рухливість сперміїв і фіксують час відтаювання. Через 5 год оцінювання повторюють. Придатною для осіменіння корів вважається сперма з вихідною рухливістю сперміїв не нижче 4 бали і виживанням 5 год.

2.4. Санітарна оцінка технологічних процесів, що застосовуються при штучному осіменінні

Дослідження сперми та змиву з препуція на бактеріальне і грибкове забруднення та колі-титр

Місце проведення заняття: лабораторія, клініка або навчальний пункт кафедри. Оснащення заняття: сперма, змиви з препуція та інструментів, середовища для розрідження сперми, живильні середовища МПА, МПБ, Кітта—Тароцці, Буліржа, Літмана, Лен НДВІ, Сабура, Чапека, МПА у бактеріологічних чашках, термостат,

предметні та накривні скельця, бактеріологічні фарби, мікроскопи.

Короткі методичні вказівки. Заняття відбувається у два етапи: спочатку роблять змиви з приладів, інструментів, беруть сперму та змиви з препуція, роблять з них посіви на живильні середовища і ставлять у термостат на пророщування. Для визна- чення мікробного та грибкового забруднення повітря ставлять відкриті чашки Петрі з МПА у приміщенні лабораторії, манежі, стаціонарі, навчальному пункті і перено- сять у термостат на пророщування. Друга частина заняття має форму студентської наукової роботи. Розділивши студентів на малі підгрупи, викладач дає конкретні завдання на час пророщування культур — приходити почергово в лабораторію кафе- дри і визначати зміни середовищ, кількість колоній, видовий склад мікробів і грибів через 24 год протягом пророщування. Потім беруть з термостату, відповідно до вказі- вки викладача, пробірки та бактеріологічні чашки із заздалегідь зробленими посі- вами і визначають їх мікробне та грибкове забруднення, як описано нижче.

Взяття змиву з препуція (рис. 30). Фіксують плідника у спеці- альному станку, обмивають йому препуцій, вставляють у його канал стерильну гумову трубку чи катетер і, з’єднавши її з шприцом, вво-

70

дять у порожнину препуція 5 – 10 мл стерильного фізрозчи- ну. Затиснувши край препуція рукою, енер- гійно масажують йо- го. Набирають розчин

ушприц і виливають

устерильну пробірку. Визначення колі-

змиву чи сперми і, додавши 1 мл стерильного фізрозчину, одержу- ють розбавлення 1 : 1. Набирають і переносять з неї 1 мл суміші в наступну пробірку і додають 10 мл стерильного фізрозчину. Так са- мо переносять з 2-ої пробірки 1 мл суміші в 3-тю і додають 10 мл фі- зрозчину, з 3-ої — у 4-ту і т. д. Отримавши, таким чином, серію роз-

ріджень 1 : 1; 1 : 10; 1 : 100; 1 : 1000; 1 : 10 000; 1 : 100 000; 1 : 1 000 000, з кожного роблять посіви на середовище Буліржа.

Зміна кольору середовища і поява у газових трубочках газу після 24-годинного перебування посівів у термостаті при температурі 37 – 37,5 °С свідчать про наявність у спермі та змиві з препуція кишко- вої палички.

Колі-титр сперми не повинен перевищувати 1 : 1 – 1 : 10, змиву з препуція — 1 : 100.

Визначення мікробного та грибкового забруднення сперми і пре- пуція. Готують серію розріджень сперми чи змиву з препуція (1 : 10, 1 : 100, 1 : 1000, 1 : 10 000 та 1 : 100 000), набирають стерильною піпе-

ткою з останніх трьох пробірок по 0,5 мл вмісту і рівномірно розподі- ляють в чашках Петрі на поверхні МПБ. Витримують чашки 15 – 20 хв (до повної абсорбції рідини в агар), перевертають догори дном, маркують склографом і переносять у термостат на 48 год. Після цього підраховують кількість колоній і перераховують на 1 мл.

Дослідження сперми та змиву з препуція на наявність синьог- нійної палички. Беруть заздалегідь приготовлені стерильні бакте- ріальні чашки з МПБ, що містить 1 – 2 % цукру і, зробивши на них посів сперми та змиву з препуція, ставлять їх на 6 – 7 діб у термо- стат при температурі 37 °С, перевіряючи посів кожні 1 – 2 дні.

Про наявність синьогнійної палички свідчить зелено-голубе за- барвлення середовища під впливом виділюваного нею піоціаніну.

Дослідження сперми на наявність анаеробних мікробів. Беруть дві пробірки із середовищем Кітта – Тароцці і вносять у них по 0,1

71

мл досліджуваної сперми. Прогрівають одну з пробірок на водяній бані при 80 °С протягом 20 хв для знищення супутньої вегетативної мікрофлори і ставлять обидві пробірки в термостат на 10 діб при 37 °С. Через 3 – 4 дні треба оцінити інтенсивність росту мікробів, ха- рактер осаду, наявність та ступінь газоутворення, зробити мазки із сперми обох пробірок, зафарбувати за Грамом і провести мікроско- пію.

Дослідження сперми та змиву з препуція на вміст грибків. Роб- лять посів сперми і змиву з препуція на одне із спеціальних середо- вищ — Літмана, Лен НДВІ, Сабура чи Чапека; культивують їх у термостаті 10 – 45 днів при температурі 22 – 37 °С. Перевіряють ви- ділені грибки на патогенність.

За аналогічною методикою проводять перевірку стерильності си- нтетичних середовищ для розрідження сперми.

Бактеріологічний контроль приладів та інструментів, які вико- ристовують для взяття і введення сперми. Взявши 5 – 10 мл стериль- ного фізрозчину, роблять змиви з підготовленої штучної вагіни, шприца-катетера, піхвового дзеркала. Вносять по 0,1 мл змиву на МПБ та середовище Кітта – Тароцці.

Далі дослідження проводять так само, як при визначенні мікроб- ного забруднення сперми.

Визначення мікробного і грибкового забруднення повітря лабо- раторії, манежу та приміщення для плідників. Ставлять на 5 хв у різних ділянках приміщення на відстані 1,5 м від підлоги відкриті бактеріологічні чашки з МПА. Після цього переносять їх у термо- стат і щодня підраховують кількість колоній та визначають видовий склад мікробів. При виявленні грибків роблять з них посіви на спе- ціальні середовища для визначення їх видового складу.

2.5. Розрідження сперми

Місце проведення заняття: лабораторія кафедри.

Мета заняття: вивчити склад основних синтетичних та біологічних середовищ для розрідження сперми, методику їх виготовлення, техніку і правила розрідження,

оволодіти основними методами біологічного контролю якості розріджувачів. Оснащення заняття: свіжовзята сперма бугая і кнура, розріджена сперма бугая,

барана, жеребця, дистильована вода, аптечні терези з наважками, необхідні реакти- ви (натрію цитрат, глюкоза, лактоза, глікокол, однозаміщений калію фосфат, хе- латон, двовуглекислий натрій, магнію сульфат, цитратна кислота, калію хлорид, амонію сульфат, вітаміни В і А в ампулах, гліцерин), бактеріостатичні речовини (стрептоцид, пеніцилін, стрептоміцин, спермосан), свіжі курячі яйця, свіже та сухе молоко, плоскодонні колби або хімічні склянки, мензурки на 50 мл, змішувачі (вели- кі й малі), бактеріологічні чашки, шприци на 20 мл, скляні палички, пеніцилінові та інсулінові флакони, гумові корки для них, марлеві серветки, спиртові тампони, па- перові фільтри; пінцети, скальпелі, термометри хімічні, мікроскопи, обігрівальні столики, скринька-термостат, предметні та накривні скельця, термоси, водяна баня (каструля), електроплитки, таз з теплою водою, одноразові скляні та поліетиленові ампули, пробірки, поліетиленові мішечки, градуйовані піпетки, фасувальний апарат

72

та апарат Флетчера, термоси різних конструкцій, кружки з поліетиленової плівки з діаметром, що відповідає отвору термоса, пластмасові круглі коробки для складання ампул, вата сіра, лід, посудини Дьюара, гумові рукавиці, захисні окуляри, спеціаль- не обладнання для розрідження сперми, автомат ПРЖ, рогова лопатка, побутовий холодильник, водяна баня.

Короткі методичні вказівки. Обговоривши з викладачем зміст заняття та одер- жавши необхідні пояснення, студенти приступають до виготовлення розріджувачів (по 100 мл, відповідно до отриманих завдань), оцінки їх і розрідження сперми.

Попередні зауваження. При розробці технології штучного осіменін- ня для кожного виду тварин були запропоновані середовища для роз- рідження сперми (глюкозо-фосфатне, жовтково-фосфатне, жовтково- цитратне, глікокол-жовтково-цитратне, молочне та ін.). Найпошире- нішими для короткочасного зберігання є глюкозо-жовтково-цитратні середовища для сперми більшості видів тварин. Перехід на викорис- тання замороженої сперми для осіменіння корів і телиць їх дещо від- тіснив, проте на практиці і в наукових дослідженнях іноді вдаються до короткочасного зберігання сперми, тому цей метод потрібно знати.

Слід дотримуватися таких вимог щодо розрідження сперми: розріджувачі мають бути ізотонічними зі спермою, тобто осмотич-

ний тиск у них має дорівнювати тиску всередині спермія; розріджувачі готують лише у скляному посуді, заздалегідь вими-

тому, простерилізованому і висушеному; розріджувач готують безпосередньо перед отриманням сперми

від плідника. Час від моменту приготування і до використання роз- ріджувача має становити не більше 1 – 2 год;

температура розріджувача в момент розрідження повинна бути 30 – 35 °С для сперми бугая, кнура і жеребця і 25 – 30 °С — для спер- ми барана;

для пригнічення мікрофлори до складу розріджувачів додають сануючі речовини в таких кількостях (з розрахунку на 100 мл): стрептоцид — 120 мг, пеніцилін кристалічний (натрієва або калієва сіль) — 25 – 50 тис. МО, стрептоміцин сірчано- або солянокислий 25 – 50 тис. МО. У середовища для кімнатних температур їх вводять у подвійній кількості;

при розрідженні сперми розріджувач приливають до сперми, а не навпаки;

перед розрідженням і після нього визначають рухливість сперміїв.

Виготовлення розріджувачів. Глюкозо-жовтково-цитратний роз-

ріджувач сперми бугая. Підвішують аптечні терези на штативі та зрівноважують їх, кладуть на обидві шальки терезів паперові філь- три однакових розмірів і ще раз зрівноважують терези.

У велику чисту хімічну колбу на 3 л наливають бідистильованої води (для усієї групи), накривають її паперовим чи поліетиленовим ковпаком, ставлять на електроплитку, доводять до кипіння й охоло- джують до температури 35°С.

На ліву шальку терезів пінцетом, що є в коробці з наважками, кладуть триграмовий тягарець, відкривають банку з глюкозою, на-

73

бирають її чистою роговою ложечкою і всипають необхідну кількість на паперовий фільтр, що лежить на правій шальці терезів. Наси- пають відважену кількість глюкози в чисту суху колбу на 100 мл і роблять про це відмітку на колбі або кладуть біля неї аркуш паперу з рецептом розріджувача та роблять у ньому відповідні позначки. Знову кладуть папірець на терези, старанно витирають рогову ло- жечку ваткою від решток глюкози, відважують так само 1,4 г натрію цитрату і 120 мг стрептоциду та всипають їх у ту саму колбу.

Відмірюють 100 мл перевареної і охолодженої до 35 °С дистильо- ваної води, вливають її у колбу з відваженими реактивами, розмі- шують скляною паличкою до повного їх розчинення і фільтрують крізь стерильний паперовий фільтр. Після цього куряче яйце миють щіткою, витирають насухо марлевою серветкою і протирають шка- ралупу тампоном, просоченим 70 %-м спиртом (рис. 31, а) або витри- мують його 10 – 15 хв у настільній бактерицидній камері під ульт- рафіолетовими променями. За допомогою стерильного скальпеля чи пінцета розколюють шкаралупу яйця на дві половини і, пере- кладаючи жовток з однієї половини на другу над чашкою, відокрем- люють його від білка (рис. 31, б).

74

Якщо неможливо відважити необхідну кількість антибіотиків, то вливають у флакон з антибіотиком 4 мл перевареної і охолодженої до 20°С дистильованої води, після повного розчинення препарату набирають необхідну його кількість і вносять у колбу, де готують розріджувач.

При приготуванні великої кількості розріджувача підбирають флакони з необхідною кількістю антибіотиків.

Глюкозо-фосфатно-жовткове середовище для сперми барана.

Відважують послідовно 3,2 г глюкози медичної безводної, 2,08 г дво- заміщеного 12-водного натрію фосфату, 0,08 г однозаміщеного калію фосфату, 0,1 – 0,2 г розчинного стрептоциду, по 50 – 75 тис. ОД пе- ніциліну та стрептоміцину. Відмірюють 100 мл кип’яченої і охоло- дженої до 36 °С дистильованої води, вливають її у колбу з відваже- ними реактивами, розмішують скляною паличкою до повного роз- чинення складників і фільтрують.

Додають 20 мл жовтка курячого яйця (як описано вище). Накри- вають колбу з розріджувачем стерильною серветкою і ставлять у ка- струлю з теплою водою.

Глюкозо-хелато-цитратно-сульфатне середовище (ГХЦС) для роз-

рідження сперми кнура. Наливають у чисту хімічну колбу 100 мл дистильованої води, додають 4 г глюкози, накривають паперовим ковпаком, ставлять на електроплитку і кип’ятять 1 – 2 хв. Знімають колбу з вогню, охолоджують її вміст до 80 °С, додають 3,8 г натрію цитрату, 0,5 г двовуглекислої соди, а потім при температурі 55 – 58 °С додають 2,6 г хелатону. Коли середовище охолоне до 40 – 45 °С, додають 25 – 30 тис. ОД спермосану.

Перевірка якості виготовлених розріджувачів. Чистою стериль-

ною скляною паличкою наносять на предметне скло краплю нероз- рідженої сперми з відомою рухливістю сперміїв. Поряд з нею нано- сять краплю перевірюваного розріджувача, накривають накривним скельцем і оцінюють під мікроскопом при температурі 38 – 40 °С рухливість сперміїв на межі злиття обох крапель. Якщо вона не знизилася, то розріджувач можна використовувати.

Розрідження сперми. Виготовивши розріджувач, кожна підгрупа студентів розріджує сперму відповідно до отриманого завдання з та- ким розрахунком, щоб уся група виготовила серію розріджень, по- чинаючи від 1 : 1 до 1 : 100.

Посуд для розріджування сперми нагрівають у термостаті чи на водяній бані до температури 30 – 35 °С. Спочатку розріджують спе- рму у спермоприймачі у співвідношенні 1 : 1, обережно додавши до неї (по стінці) однакову кількість розріджувача. Потім переносять у підігрітий до 30 – 35 °С градуйований змішувач 1 мл цієї сперми і доливають до неї поступово по стінці таку кількість розріджувача, щоб досягти необхідного ступеня розрідження. Після доливання кожної порції розріджувача старанно змішують його зі спермою.

75