3.8. Методи зберігання ембріонів

Мета заняття: Оволодіти методами культивування, короткочасного і тривалого зберігання вимитих ембріонів.

Місце проведення заняття: лабораторія кафедри, центр трансплантації ембріонів. Оснащення заняття: взяті ембріони, середовище Дюльбекко, фетальна сироватка,

96 %-й спирт, диметилсульфоксид, гліцерин, сахароза, годинникові скельця, малі і великі чашки Петрі, пайєти, градуйовані скляні циліндри на 500 мл, ділильна лій- ка, сифонні шланги, пастерівські піпетки, пробірки, ампули, термостат, інвертова- ний мікроскоп, апарат для кріоконсервування ембріонів, бінокулярна лупа, паперові фільтри, бактерицидні лампи, халати, ковпаки.

Короткочасне зберігання ембріонів. Від вимивання ембріонів до пересадки їх реципієнтам проходить звичайно не менше 3 год. Протягом цього часу потрібно зберегти життєздатність ембріонів. Для цього їх можна помістити в 0,5 мл середовища для культиву- вання ембріонів на годинниковому скельці, поставити його в сте- рильну чашку Петрі, дно якої вистелене вологим фільтрувальним папером, накрити і поставити в термостат з температурою 37 °С.

Для тривалого зберігання ембріона його засмоктують в пайєту так, щоб з обох боків його утворилися повітряні пухирці довжиною 1 – 1,5 см. Закривають кінці пайєти сталевими кульками або полі- етиленовими корками і вміщують у термостат при 37 °С. Можна збе- рігати ембріони і під шаром стерильного вазелінового масла на го- динниковому склі чи в пробірці. За таких умов біологічно повноцін- ні ембріони можуть культивуватися протягом 24 – 48 год, хоча цим методом користуються лише як вимушеним заходом. В кінці куль- тивування обов’язково перевіряють під мікроскопом життєздатність ембріонів. Зберігають ембріони також при знижених плюсових тем- пературах, що викликають зворотне гальмування метаболічних процесів.

Кріоконсервування ембріонів. Оптимальною стадією для замо- рожування ембріонів великої рогатої худоби є рання бластоциста, овець і кіз — пізня морула або рання бластоциста, свиней — блас- тоциста. Краще витримують заморожування свіжі ембріони.

Заморожування ембріонів набагато складніше, ніж заморожу- вання сперми, тому що вони є багатоклітинними утвореннями.

Для того, щоб запобігти кристалізації внутрішньоклі- тинної води, до складу середо- вища додають кріопротектори

певній стадії.

126

На перших етапах розробки технології насичення (еквілібрації) кріопротектором середовища з ембріоном проводили, поступово пе- реносячи ембріони на годинникових скельцях у чашці Петрі з роз- чину з меншою концентрацією кріопротектора у розчин з вищою його концентрацією (0,25; 0,5; 1,0; 1,5 М ДМСО), витримуючи у кож- ній з них по 5 хв (чи 3,3; 6,6 та 10 %-му гліцерині). Закінчивши «на- сичення» ембріонів кріопротектором, їх розфасовували в пайєтах у такій послідовності: середовище — повітря — середовище з ембріо- ном — повітря — середовище (рис. 65). Кожен стовпчик має дов- жину 1 – 2 см. Один край пайєти закривали зволоженим корком, після чого заморожували.

Для зниження перепаду температур і уникнення осмотичних змін за 3 – 4 с до початку утворення льоду (мінус 6 – 7 ºС) стимулю- вали кристалізацію, додаючи до розчину зернину льоду, кристалик срібла йодиду чи просто торкаючись переохолодженим предметом (проколюють фольгу пінцетом з намерзлою на кінці краплею сере- довища і швидко торкаються нею поверхні рідини).

Після розморожування ембріонів їх відмивали від кріопротекто- ра, переносячи поступово з розчинів з більшою концентрацією кріо- протектора в менш концентровані розчини з часом витримування в кожному розчині ДМСО 5 хв, а в гліцерині — 10 хв.

Нині застосовують простіший (одноступінчастий) метод насичен- ня кріопротектором. Після морфологічної оцінки та відмивання ем- бріонів від механічних забруднень їх вміщують у 1,4 М розчин глі- церину і витримують 15 – 20 хв. Для приготування розчину до 9 мл одного із середовищ для тканинних культур або Дюльбекко з 0,4 %-м бичачим сироватковим альбуміном додають 1 мл гліцерину. Для запобігання контамінації ембріонів патогенними та умовно пато- генними мікроорганізмами середовище проціджують крізь фільтр типу «Мілекс», «Millipore» з діаметром пор 0,22 мк.

Після витримування ембріонів у 1,4 М розчині гліцерину їх пе- реносять у соломинки (пайєти) в такій послідовності, як зазначено вище.

Розморожують ембріони, заморожені в пробірках, у водяній бані при температурі 30 – 35 ºС. Заморожені в пайєтах ембріони вийма- ють з посудини Дьюара, витримують 6 – 8 с на повітрі при кімнат- ній температурі, вміщують у водяну баню при температурі 25– 30 ºС на 10 – 15 с до зникнення льоду. Після цього видаляють із пайєти маркерний корок, зрізають ножицями ватний корок і вміст соломин- ки зливають на годинникове скельце.

Останнім часом запропоновано технології заморожування ембрі- онів у соломинках, які містять одночасно два середовища — для за- морожування (1,5 М розчин гліцерину та ФБС з додаванням 10 %-ої

127

сироватки крові і вміщеним у ній ембріоном) та середовище для роз- морожування (1,08 М розчин сахарози на ФБС).

Сахароза прискорює видалення кріопротектора при розморожу- ванні ембріонів. Не проникаючи в клітини, вона підтримує постійну зовнішню осмомолярність і пом’якшує осмотичний шок. Розчин са- харози засмоктують у пайєту з просоченим кріопротектором ембріо- ном з таким розрахунком, щоб між цими двома розчинами був пу- хирець повітря.

Простерилізований фільтрацією 1,5 М розчин гліцерину на фос- фатно-буферному середовищі з додаванням 10 %-ої сироватки крові набирають у пайєту на 5 мм довжини стовпчика, за ним має бути такої ж довжини пухирець повітря, далі засмоктують на таку саму довжину середовище з ембріоном і знову пухирець повітря. Нареш- ті, набирають на таку саму довжину 1,08 М розчин сахарози у фос- фатно-буферному середовищі. Закривають один край пайєти зволо- женим корком і заморожують.

Після розморожування соломинку струшують (для змішування середовищ), витримують 10 – 20 хв при кімнатній температурі і пе- ресаджують ембріон реципієнтові.

В Інституті тваринництва УААН при заморожуванні ембріонів за сповільненим режимом насичення ембріонів кріопротектором про- водять одноступенево, використовуючи для цього 1,2 М розчин глі- церину, в 20 %-й фетальній сироватці (ФС) на ФБС.

Насичені гліцерином зародки розфасовують у пайєти, а саме: спочатку набирають 0,75 М розчин сахарози на 20 %-му розчині фе- тальної сироватки в ФБС, потім пухирець повітря довжиною 2 – 3 мм, далі ембріон в 1 М розчині гліцерину в 20 %-му розчині ФС на ФСБ, знову пухирець повітря 3 – 5 мм і, нарешті, знову 0,75 М розчин са- харози в 20 %-му розчині ФС в ФБС.

Установка для заморожування ембріонів складається з посудини Дьюара, в яку за допомогою відповідного пристосування й термопа- ри з заданою програмою охолодження опускають контейнер із запов- неними ембріонами пайєтами.

Для розморожування пайєт їх переносять з каністри посудини Дьюара у водяну баню кімнатної температури (20 – 22 °С).

При надшвидкому методі заморожування ембріони мікропіпет- кою переносять у краплю (150 – 300 мкл) еквілібрувального розчину (10 %-го розчину гліцерину на 20 %-й ФС в ФБС) у чашці Петрі і витримують 10 хв, а потім — в іншу чашку Петрі з розчином для заморожування (суміш 30 %-го гліцерину і 70 %-го 1 М сахарози на 20 %-му розчині ФС в ФБС), заправляють у соломинку об’ємом 0,25 мл і занурюють у рідкий азот.

128

Розморожування ембріонів проводять на водяній бані при 40 °С протягом 5 с і видувають середовище з ембріоном у краплю 1 М роз- чину сахарози на 20 %-й ФС в ФБС. Через 7 хв переносять ембріони в поживне середовище, заправляють у соломинку, як вказувалося вище, і використовують для трансплантації.

3.9. Пересадка ембріонів

Мета заняття: оволодіти методами хірургічної і нехірургічної пересадки ембріонів. Місце проведення заняття: кафедра, навчальний пункт трансплантації ембріо-

нів, м’ясокомбінат.

Оснащення заняття: телиці-реципієнти або модельні тварини, статеві органи за- битих на м’ясокомбінаті тварин, заправлені у пайєти ембріони, 2 %-й розчин новока- їну, ксилокаїну, медокаїну, прокаїну та діоциду, ромпун, комбелен, 96 %-й спирт, вата, гнучкий прилад Касу та катетер для пересадки ембріонів, захисні чохли, гіне- кологічні рукавичці, розширювачі (дилятатори шийки матки), інвертований мікро- скоп, бінокулярна лупа, пересувний столик для інструментів, халати, фартухи, гумо- ві чоботи.

Короткі методичні вказівки. Спочатку викладач демонструє студентам окремі прийоми введення катетера через закриту шийку матки на органах забитих тварин, потім — на модельних тваринах. Розділившись на підгрупи по 2 – 3 особи, студенти почергово оволодівають методом введення катетера через шийку матки в ріг матки і пересадки ембріонів.

Нині пересадку ембріонів здійснюють переважно нехірургічним методом (рис. 66). Потрібні для цього інструменти — металевий ка- тетер і довга капілярна трубка, в передній частині якої є приставка для поміщення ембріона в невеликій кількості середовища.

Якщо пересадку здійснюють за допомо- гою гнучкого приладу Касу, то ембріон треба помістити в пайєту (со- ломинку), як зазначено

вище, вставити її в на- Рис. 66. Схема нехірургічної пересадки ембріонів

конечник приладу і з’єднати його з основ- ною трубкою.

Тварину-реципієнта фіксують у станку і проводять ректо-гені- тальне обстеження на наявність жовтого тіла в яєчнику. Тварини, у яких не виявлено жовтого тіла, до пересадки не допускаються.

Звільняють пряму кишку тварини від калових мас, обмивають теплою водою з милом і обробляють 70 %-м спиртом, септонексом чи 2 %-м розчином діоциду перинеальну ділянку, роблять сакральну анестезію 2 %-м розчином новокаїну (4 – 7 мл), сильнозбудливим тваринам вводять міорелаксант ромпун чи комбелен (0,5 мл).

129

У праву руку беруть вставлений у спеціальний санітарний чохол чи гінекологічну рукавицю відповідно підготовлений і заправлений ембріоном катетер і вводять його по верхньому склепінню піхви до шийки матки. Ліву руку вводять у пряму кишку, промацують мат- ку, визначають, у якому яєчнику є жовте тіло. Далі проривають са- нітарний чохол і обережно проводять інструмент крізь шийку матки в іпсілатеральний ріг на глибину 7 – 12 см.

Пересвідчившись, що інструмент введено правильно, вводять вміст катетера в матку. Після цього обережними рухами виймають катетер і передають його на обробку. Аналогічно можна ввести ін- ший катетер у другий ріг матки і зробити так звану білатеральну (двосторонню) пересадку ембріонів, хоча відсоток приживлення їх у контрлатеральному розі буває дещо нижчим.

Не рекомендується протягом двох місяців після пересадки ембріо- нів вакцинувати реципієнтів, перегруповувати їх чи піддавати ін- шим стресовим впливам. Через 60 – 75 днів після пересадки ембріо- нів реципієнтів досліджують на вагітність.

130