Вопрос 11. Цитогенетический метод.

ОТВЕТ. Цитогенетический метод это метод изучения хромосомных болезней человека.

Цитогенетический метод:

• опирается на кариотипирование (изучение идиограмм кариотипа человека);

• исследования полового хроматина.

КАРИОТИПИРОВАНИЕ

Методы изучения хромосом:

1. Прямой метод – исследование клеток костного мозга (используется редко)

2. Непрямые методы исследование:

• крови,

• фибробластов кожи,

• клетки абортированного плода,

• некропсия органов.

Цель изучения кариотипов:

1. определения хромосомных аномалий;

2. определение пола при отсутствии фенотипической идентицикации (для МГК, судебно-медицинской экспертизе).

Этапы микроскопического исследования кариотипа:

1. культивирование клеток человека (чаще лимфоцитов) на искусственных питательных средах;

2. стимуляция митозов фитогемагглютинином (ФГА);

3. добавление колхицина (разрушение нити веретена деления, блокирует синтез белков тубулинов) для остановки митоза на стадии метафазы;

4. обработка клеток гипотоническим раствором, вследствие чего хромосомы рассыпаются и лежат свободно;

5. окрашивание хромосом;

6. изучение под микроскопом и фотографирование;

7. вырезание отдельных хромосом и построение идиограммы.

Показания к кариотипированию (в системе МГК):

1. множественные врожденные пороки развития (МВПР);

2. привычные выкидыши;

3. недифференцированные олигофрении;

4. подозрение на семейную транслокацию;

5. пренатальная диагностика в случае пожилого возраста родителей;

6. уточнение диагноза при нарушении в системе половых хромосом.

ПРИРОДА ПОЛОВОГО ХРОМАТИНА

В 1949 г. М. Барр и Е. Бер, изучая нейтроны кошки, обратили внимание на то, что в интерфазном ядре клетки содержится интенсивно окрашиваемые тельце, причем оно присутствует только в ядрах клеток самок и отсутствует у самцов. Это тельце получило название полового хроматина., или тельца Барра. У ряда позвоночных и у человека оно появляется в онтогенезе на стадии гаструлы, но раньше развития гонад (половых желез). На локализацию, форму и структуру полового хроматина не влияют половые гормоны, следовательно, он не является вторичным половым признаком. Между числом телец полового хроматина и числом Х-хромосом в ядре имеется прямая связь. Половой хроматин в интерфазных ядрах обусловлен спирализацией одной из Х-хромосом, инактивация которой является механизмом, выравнивающим баланс генов половых хромосом в клетках самцов и самок (т.е. это один из механизмов дозовой компенсации генов).

Если у женщины в ядре клетки несколько Х-хромосом, то в клетках нескольких телец Бара, активной остаётся лишь одна Х-хромосома. Х-хромосома инактивируется не вся, часть короткого плеча остается генетически активной. Инактивация Х-хромосомы в определенной мере зависит от стадии клеточного цикла и физиологического состояния организма. По наличию лишнего или отсутствие тельца Бара можно диагностировать некоторые виды наследственных заболеваний (например, синдром Клайнфельтера, синдром Шерешевского-Тернера). Клетки, не содержащие половой хроматин (хроматин-отрицательные клетки) обнаруживаются у индивидуумов, имеющих набор хромосом 45, ХО (синдром Шерешевского-Тернера), 46, ХУ (нормальные мужчины); 47, ХУУ (синдром Клайнфельтера с двумя У-хромосомами). Обычно в клетках нормального мужского организма встречается некоторое количество псевдотелец Барра (конденсированных участков аутосом) и спирализованных У-хромосом, поэтому при диагностике различных хромосомных заболеваний необходимо уметь отличать эти образования от типичного полового хроматина, образованной спирализованной лишней Х-хромосомой. Число телец полового хроматина (В) в диплоидной клетке равно числу Х-хромосом (Х) минус единица (В = Х - 1):

• одно тельце Барра обнаруживается при хромосомном наборе 46, ХХ (нормальные женщины); 47, ХХУ и 48, ХХУУ (классический синдром Клайнфельтера);

• два тельца Барра обнаруживаются у человека, имеющего три Х-хромосомы, (47, ХХХ); три Х-хромосомы и одну У (48, ХХХУ, синдром Клайнфелътера); 49, ХХХУУ (синдром Клайнфельтера);

• три тельца Барра встречаются при кариотипе 48, ХХХ 49 ХХХХУ (тяжелый синдром Клайнфельтера).

Есть флюоресцирующий метод определения числа У-хромосом, каждая У-хромосома имеет вид флюоресцирующей палочки; сколько У-хромосом в клетке, столько и флюоресцирующих палочек

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛОВОГО ХРОМАТИНА В СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКЕ ПОЛОСТИ РТА (буккальный тест).

На уровне 2-х коренных зубов штапелем делается соскоб со слизистой оболочки полости рта. Соскоб наносится на предметное стекло, делается мазок. На мазок наносится капля краски (ацетоорсеин) покрывается покровным стеклом. Препарат “давленный”, для чего покровное стекло нажимают кулаком. Препарат парафинируют, смотрят под микроскопом. За Х-хроматин принимается хроматин, который находится на границе ядерной оболочки и структуры ядра.

Другой метод определения количества Х-хромосом в соматической клетке – это метод «барабанных палочек» в мазке крови: сегментированный лейкоцит может иметь или нет «барабанные палочек» – особый сегмент на гетерохроматиновой массе ядра лейкоцита. Количество этих выростов («барабанные палочек») пропорционально количеству глыбок полового хроматина (телец Бара).

Показания к исследованию полового хроматина:

Состояния	Х- хроматин	У- хроматин
1. Пренатальная диагностика пола	+	+
2. Неясен пол новорожденного	+	+
3. Недифференцированная олигофрения	+	+
4. Первичная аменорея	+	-
5. Нарушение менструального цикла	+	+
6. Бесплодие у мужчин и женщин*	+ *	+