Биохимия растений

На усвоение мочевины в результате обращения реакций орни˝- тинового цикла затрачивается метаболическая энергия, ко˝торая генерируется через усиление дыхания, наблюдаемое при так˝их процессах.

Понимание механизмов усвоения растениями мочевины имее˝т важное значение в связи с ее широким использованием в кач˝естве

азотного удобрения, которое применяется как для корневог˝о питания растений, так и в виде некорневых подкормок.

Некорневые подкормки чаще всего проводятся при возделыв˝а-

нии пшеницы и кукурузы. Растения опрыскивают раствором мо˝-

чевины с помощью самолетов или при наличии технологическ˝ой

колеи наземными агрегатами в фазах формирования — нача˝ла молочной спелости зерна. Нанесенная на листья мочевина быст˝ро

проникает в их ткани и включается в синтез аминокислот и б˝ел-

ков, увеличивая таким образом накопление в зерне запасных˝ бел-

êîâ íà 1—3 %.

В наших опытах с использованием мочевины, меченной 15N, показано, что азот некорневой подкормки, проведенной в фа˝зу

начала формирования зерна пшеницы, в зрелых зерновках обы˝чно

составляет около 10 % общего белкового азота зерна. Из этого˝ сле-

дует, что в результате поздней некорневой подкормки в зер˝новках

пшеницы дополнительно может синтезироваться до 10 % общей˝ массы белков, накапливающихся в зерне. Кроме того, мочевин˝а

при поздней некорневой подкормке оказывает физиологиче˝ски

активное действие на растения, усиливая отток азотистых в˝еществ

из листьев в созревающие зерновки. Под действием подкормк˝и

мочевиной в зерне пшеницы существенно снижается активно˝сть α-амилаз и других гидролитических ферментов, что способств˝ует улучшению технологических свойств зерна. Благодаря прим˝ене-

нию некорневых подкормок мочевиной в поздние фазы развит˝ия растений можно значительно увеличить выход зерна пшениц˝ы с высоким содержанием клейковины.

11.5. СИНТЕЗ АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НИТРАТНОЙ ФОРМЫ АЗОТА

В большинстве почв, особенно окультуренных, довольно активно происходит процесс нитрификации, в ходе которого ам˝монийная форма азота, образующаяся в почве при распаде орга˝ни- ческих остатков, а также внесенная в виде удобрений, превр˝аща-

ется в нитраты. Поэтому бó льшая часть азота, поступающая в рас-

тения при корневом питании, представлена нитратами, котор˝ые

очень легко усваиваются растениями, включаясь в синтез ам˝ино-

кислот. Поскольку в составе аминокислот азот находится в ˝амин-

451

ной форме, нитратный азот в растениях, прежде чем включить˝ся в состав аминокислот, подвергается восстановлению в аммон˝ийную форму с помощью специальных ферментных систем.

Восстановление нитратного азота в аммонийный в клетках рас-

тений, водорослей, грибов и бактерий осуществляется в два˝ этапа. На первом этапе под действием фермента нитратредуктазы ïðî-

исходит превращение нитратов в нитриты, а затем нитриты с˝ уча- стием фермента нитритредуктазы восстанавливаются с образова-

нием аммонийной формы азота, которая используется для син˝теза

аминокислот и амидов. Схематически эти процессы можно пре˝д-

ставить следующим образом:

NO–3 ¾¾® NO–2 ¾¾® NH+4

Нитратредуктазы высших растений, зеленых водорослей и гри-

бов (1.6.6.1; 1.6.6.2; 1.6.6.3) представляют собой металлофлавопротеиды с молекулярными массами 200—330 тыс., включающие два

типа субъединиц. В составе фермента содержатся флавиновы˝е группировки (ФАД, ФМН) и молибденовый кофермент. Донором

электронов для восстановления нитратного азота у растен˝ий слу-

жит НАД · Н, у грибов — НАДФ · Н. От восстановленных пири˝- диндинуклеотидов электроны и протоны перемещаются на фл˝а- виновую группировку нитратредуктазы. Затем электроны переда-

ются на цитохром b557, служащий в составе фермента промежуточ-

ным переносчиком электронов от флавинового кофермента н˝а молибденовый, а протоны высвобождаются и могут взаимодей˝-

ствовать с анионами кислорода, которые образуются при вос˝становлении нитратного азота.

Молибденовый кофермент содержит катионы молибдена, лабильно связанного с ароматической группировкой, которая˝ неко-

валентно присоединяется к белковой части фермента. Катио˝ны молибдена, обратимо изменяя степень окисления, способны а˝к- цептировать электроны от цитохрома b557 и передавать их на азот нитрата, который связывается с активным центром фермента˝. В результате восстановления азота нитрат превращается в н˝итрит, а высвобождающийся анион кислорода О2– соединяется с протона-

ми, образуя молекулу воды. Механизм восстановления нитрат˝ов

до нитритов под действием нитратредуктазы может быть пре˝д-

ставлен в виде следующей схемы:

452

Суммарно процесс восстановления нитратов в растениях по˝д действием фермента нитратредуктазы может быть выражен с˝ледующим уравнением:

NÎ3– + ÍÀÄ · Í + Í+ → NO–2 + ÍÀÄ+ + Í2Î

Óбактерий нитратредуктазы представлены относительно н˝изкомолекулярными белками (70—180 тыс.), не содержащими фла-

виновых группировок. Донором электронов у них служат восс˝та-

новленный ферредоксин или его аналоги. Нитратредуктазы б˝акте-

рий тесно связаны с клеточными мембранами, тогда как у выс˝ших

растений, зеленых водорослей и грибов эти ферменты локали˝зованы в цитоплазме.

Óрастений наиболее высокая нитратредуктазная активнос˝ть

обнаруживается в меристематических тканях. У большинств˝а рас-

тений при активном фотосинтезе и достаточном количестве˝ угле-

водов, являющихся источниками образования НАД · Н, проце˝сс восстановления нитратов практически полностью происход˝ит в

корнях. Однако при недостатке света и низких температурах˝, ос-

лабляющих синтез углеводов, а также избыточном азотном пи˝та-

нии значительная часть нитратов поступает в вегетативну˝ю часть

растений и подвергается восстановлению в листьях. Вместе˝ с тем известны растения, у которых практически не обнаруживает˝ся

нитратредуктазной активности в корнях. У них превращение˝ нит-

ратного азота в аммонийный осуществляется в основном в ли˝сть-

ях. К таким растениям относятся свекла, хлопчатник, марь, ду˝р-

нишник и др.

Нитратредуктаза — типичный индуцибельный фермент. Его активность резко возрастает при поступлении в растения н˝итратов

вследствие того, что происходит индукция синтеза фермент˝а. Когда же концентрация нитратов в клетках растений уменьшает˝ся, синтез ферментного белка прекращается и нитратредуктаз˝ная активность снова понижается до исходного уровня. Кроме нитр˝атов

индукторами синтеза нитратредуктазы могут быть цитокин˝ины и

органические нитросоединения, т. е. возможна индукция си˝нтеза этого фермента под воздействием химических регуляторов. В то же время катионы аммония подавляют в растениях синтез нит˝ратредуктазы. В опытах показано, что индукция синтеза нитрат˝ре-

дуктазы в присутствии нитратов происходит на свету, а в те˝мноте

усиливается деградация этого фермента.

Активность фермента нитратредуктазы в значительной сте˝пени определяется присутствием в физиологической среде окис˝лителей

èвосстановителей. В восстановительных условиях бó льшая часть

активного фермента, находящегося в окисленной форме, пере˝во-

дится в неактивное (восстановленное) состояние, в результ˝ате

453

нитратредуктазная активность в тканях растений понижае˝тся. Такое явление, например, наблюдается при переносе растений ˝в темноту. Однако при освещении растений очень быстро осуще˝-

ствляется фотореактивация фермента, т. е. перевод его из ˝восста-

новленной в окисленную форму, вследствие чего процесс восстановления нитратов снова активируется.

Восстановление нитритов в аммонийную форму азота катали˝-

зируют ферменты нитритредуктазы (1.6.6.4; 1.7.99.3). У растений и

фотосинтезирующих водорослей эти ферменты представляют˝ со-

бой сравнительно низкомолекулярные белки (60—70 тыс.), кото-

рые содержат в качестве активных группировок железосерный центр (4Fe4S) и сирогем (железотетрагидропорфирин). Донором

электронов служит восстановленный ферредоксин, поэтому˝

нитритредуктазы у указанных организмов локализованы в хло-

ропластах.

Ферредоксин передает электроны на железосерный центр ни˝т- ритредуктазы, который далее восстанавливает сирогем, спо˝соб-

ный передавать электроны на атомы азота нитритов, в резул˝ьтате

происходит присоединение к ним протонов и образование ам˝мо-

нийной формы азота. Высвобождающиеся анионы кислорода О2–,

реагируя с катионами Н+, дают молекулы воды. Перенос электронов от восстановленного ферредоксина на нитриты с участи˝ем

нитритредуктаз можно представить в виде следующей схемы˝:

Суммарное уравнение процесса восстановления нитритов п˝од

действием нитритредуктазы можно записать в следующем ви˝де:

Каталитическая активность нитритредуктаз в 5—20 раз превы˝- шает активность нитратредуктазы, поэтому нитриты, как пра˝вило,

не накапливаются в растениях. В корнях нитритредуктазная˝ ак-

тивность локализована в пропластидах, и донорами электро˝нов для восстановления нитритов здесь служат восстановленн˝ые динуклеотиды НАДФ · Н.

Нитритредуктазы, как и нитратредуктазы, — индуцибельны˝е ферменты. Индукцию их синтеза вызывают нитраты, а репрес-

сию — катионы аммония.

В отличие от нитритредуктаз растений и водорослей аналог˝ич- ные ферменты бактерий и грибов представляют собой более в˝ысо-

комолекулярные формы, содержащие флавиновые коферменты˝.

454

Донорами электронов для них служат восстановленные дину˝клеотиды НАД · Н и НАДФ · Н.

Существующие разновидности растений очень сильно разли˝ча- ются по способности восстанавливать нитраты, которая зав˝исит

главным образом от уровня нитратредуктазной активности˝, тогда как нитритредуктазы — каталитически более активные фер˝менты.

Общий уровень нитратредуктазной активности определяетс˝я, с одной стороны, интенсивностью синтеза ферментного белка˝, а с

другой — каталитической способностью фермента.

Чтобы добиться усиления синтеза нитратредуктазы в расти˝-

тельных тканях, проводятся молекулярно-генетические исследо-

вания, связанные с воздействием на регуляторные гены, оказывающие влияние на скорость синтеза ферментного белка. Одн˝о-

временно с этим ведется поиск химических регуляторов, уси˝ли-

вающих действие генетической системы синтеза фермента

нитратредуктазы. В целях повышения каталитической актив˝ности

нитратредуктазы в растительных тканях на молекулярном у˝ровне разрабатываются способы введения в геном растений генов˝ из

клеток бактерий, кодирующих более активные молекулярные˝

формы нитратредуктазы. Кроме того, в результате применени˝я

методов белковой инженерии предпринимаются попытки опт˝и-

мизации структуры фермента путем замены отдельных нуклеотидных остатков в структурных генах нитратредуктазы, что пре˝допре-

деляет синтез видоизмененного белка с повышенной катали˝тиче-

ской активностью.

Цель таких работ — повысить эффективность использовани˝я

нитратного азота для синтеза азотистых веществ и таким об˝разом увеличить продуктивность растений. Вторая важная задача˝ — понизить накопление нитратов, так как они потенциально опас˝ны

для человека и животных. Нитраты очень легко восстанавлив˝аются в нитриты неферментативным путем, а последние взаимодействуют с гемоглобином, переводя его в окисленную форму — ˝метгемоглобин, не способный осуществлять функцию транспорт˝а

кислорода, в результате чего ухудшается обеспеченность и˝м орга-

низма. Кроме того, нитриты являются химическими предшеств˝енниками нитрозоаминов, обладающих мутагенным и канцероге˝н- ным действием.

Известны группы растений с природно невысоким уровнем

нитратредуктазной активности, вследствие чего они накап˝ливают

высокие концентрации нитратов. К таким видам относятся ра˝стения семейства тыквенных, шпинат, редька и др. Однако у боль-˝ шинства растений повышение содержания нитратов наблюда˝ется

при определенных неблагоприятных условиях выращивания,˝ свя-

занных с недостатком световой энергии; низкой температур˝ой;

недостатком фосфора, калия, ряда микроэлементов; избыточн˝ы-

455

ми дозами азотных удобрений. Поэтому для каждой группы ра˝стительных продуктов установлена предельно допустимая кон˝центрация нитратов.

При недостатке света ослабляются процессы фотосинтеза и˝ ды-

хания, в результате чего понижается скорость образования˝ восстановленных динуклеотидов и восстановленного ферредоксин˝а,

служащих донорами электронов для восстановления нитратов, поэтому значительная их часть остается невосстановленной˝ и не ис-

пользуется для синтеза азотистых веществ растений. Аналогичное

явление наблюдается в условиях пониженных температур, ко˝гда

замедляются биосинтетические процессы, связанные с реге˝нера-

цией доноров электронов для нитратвосстанавливающей си˝стемы, тогда как поступление нитратов в растения продолжается, в˝след-

ствие чего их концентрация в растительных тканях увеличи˝вается.

Заметное влияние на функционирование нитратвосстанавли˝ва-

ющей системы растений оказывает обеспеченность их микро˝эле-

ментами — молибденом, железом, магнием, марганцем, медью,˝ которые служат активаторами нитратредуктазы, нитритредуктазы

и других ферментов азотного обмена. Особенно важна роль мо-

либдена, входящего в состав молибденового кофермента нит˝рат-

редуктазы. При недостатке молибдена и других микроэлемен˝тов

замедляется процесс восстановления нитратов и происход˝ит их накопление в растительных продуктах. Еще большее накопле˝ние

нитратов в растениях наблюдается при внесении избыточны˝х доз

азотных удобрений, а также при недостаточной обеспеченно˝сти

растений фосфором и калием, когда формируется низкий урож˝ай.

В этих условиях даже умеренные дозы азотных удобрений мог˝ут оказаться избыточными.

Таким образом, для предотвращения накопления в растениях˝

большого количества нитратов необходимо правильно разр˝абатывать технологию выращивания растений, обеспечивая оптим˝альное питание растений макро- и микроэлементами. Особенно в˝ажно контролировать уровень азотного питания при выращива˝нии

овощных и кормовых культур.

11.6. СИНТЕЗ АМИНОКИСЛОТ ПРИ ВОССТАНОВЛЕНИИ МОЛЕКУЛЯРНОГО АЗОТА

Известны группы растений, способные за счет симбиоза с кл˝етками микроорганизмов использовать для синтеза своих азо˝тистых

веществ молекулярный азот, который содержится в большом к˝о-

личестве в земной атмосфере. Этот процесс в биологии называют

симбиотической азотфиксацией. У таких растений в специальных

структурных образованиях на корнях или в листьях осущест˝вля-

456

ют жизнедеятельность микроорганизмы-симбионты: клубеньковые бактерии, актиномицеты, цианобактерии (синезеленые в˝одоросли).

Большинство растений, способных к симбиотической азотфи˝к-

сации, образуют на корнях или листьях утолщенные выросты,˝ называемые клубеньками, в которых находятся видоизмененны˝е

клетки микроорганизмов-симбионтов. Такие микроорганизм˝ы, находящиеся в клубеньках, питаются растительными метабо˝лита-

ми, которые образуются из поступающих в клубеньки фотоасс˝и-

милятов, а продукты их жизнедеятельности, синтезируемые з˝а

счет связывания молекулярного азота атмосферы, использу˝ются

растениями для новообразования азотистых веществ.

На корнях многих древесных и кустарниковых растений (оль˝-

ха, облепиха, восковница и др.) формируются клубеньки, обра˝зуе-

мые актиномицетами. Экспериментально определено, что дре˝вес-

ные насаждения ольхи за счет симбиотической азотфиксаци˝и спо-

собны связывать в течение одной вегетации до 100 кг атмосфе˝рного азота на 1 га. На корнях некоторых австралийских цикадо˝вых

растений в качестве симбионтов развиваются цианобактер˝ии,

фиксирующие молекулярный азот. У некоторых растений се-

мейств Rubiaceae и Haloragaceae цианобактерии образуют клу-

беньки на листьях. На рисовых полях в южных странах развод˝ят водяной папоротник Azolla, в листьях которого осуществляют

жизнедеятельность симбиотические азотфиксирующие циан˝обак-

терии. За счет его культивирования рисовые поля обогащают˝ся

азотом.

У бобовых растений в клубеньках живут бактерии рода Rhizobium. С их участием бобовые культуры могут фиксировать в год от 50 до 600 кг молекулярного азота на 1 га, практически по˝л-

ностью обеспечивая свои потребности в азотном питании. Кр˝оме того, в результате минерализации пожнивных остатков этих˝ культур происходит существенное обогащение почвы доступным˝ для усвоения последующими культурами азотом. Особенно много˝ азо-

та могут накапливать за счет симбиотической азотфиксаци˝и лю-

церна (300—500 кг · га–1), клевер (200—300 кг · га–1), люпин (100— 200 кг · га–1).

Восстановление молекулярного азота в аммиачный катализ˝ирует ферментный комплекс нитрогеназы (1.18.2.1), состоящий из

двух белков. Один из них, высокомолекулярный, осуществляе˝т

непосредственно восстановление молекул азота. Он предст˝авляет собой тетрамер, состоящий из двух типов субъединиц, входя˝щих поровну в состав тетрамерного белка (α2β2). В каждой молекуле

тетрамера содержится два атома Мо, с каждым из которых вза˝и-

модействуют три 4Fe4S-кластера, образуя каталитический центр˝.

С ним связываются молекулы азота и подвергаются восстано˝вле-

457

нию. Белковый компонент нитрогеназы, катализирующий восс˝тановление молекулярного азота, называют Мо, Fe-белком.

В составе нитрогеназы содержится также низкомолекулярн˝ый белок, состоящий из двух одинаковых полипептидных субъед˝и-

ниц. Он включает в качестве активной группировки 4Fe4S-клас- тер и выполняет функцию восстановления Mo, Fe-белка посред-

ством переноса электронов от восстановленного ферредок˝сина. Поскольку низкомолекулярный компонент нитрогеназы соде˝ржит

железосерную группировку, его называют Fe, S-белком. Следует˝

отметить, что перенос электронов от Fe, S-белка на Mo, Fe-белок

сопряжен с гидролизом АТФ. С помощью молекулярных расчето˝в

определено, что перенос каждой пары электронов в ферментн˝ом комплексе нитрогеназы сопряжен с гидролизом 4—5 молекул А˝ТФ.

Молекулярная масса Fe, S-белка клубеньков бобовых растений

составляет ~65 тыс., Mo, Fe-белка — порядка 200 тыс. По-видимо-

му, восстановление азота происходит в три стадии. Вначале моле-

кула азота, акцептируя два электрона и два протона, превра˝щается в диимид. Затем к атомам азота диимида в составе ферментно˝го

комплекса присоединяются еще два электрона и два протона˝ с

образованием гидразина. На конечной стадии в результате п˝ри-

соединения двух электронов и двух протонов гидразин восс˝та-

навливается в аммиачную форму азота, которая высвобождае˝тся из ферментного комплекса и используется далее для синтез˝а

аминокислот.

Ключевую роль в восстановлении молекул азота в активном

центре нитрогеназы играют атомы молибдена. Последовател˝ь-

ность восстановительных реакций в активном центре нитро˝геназы может быть представлена в виде следующей схемы:

Нитрогеназа, катализирующая симбиотическую азотфикса-

цию, локализована в клетках клубеньков на корнях или лист˝ьях

растения-симбионта.

Наиболее хорошо изучен процесс азотфиксации в клубенька˝х

бобовых растений. Бактерии рода Rhizobium проникают в ткани коры корней бобового растения и инициируют в них интенсив˝ное

458

деление клеток, что приводит к образованию на корнях утол˝щений в виде клубеньков. Возникновение клубеньков — резул˝ьтат довольно сложного взаимодействия растения с клубеньков˝ыми бактериями на генетическом и молекулярном уровнях.

Инициаторами такого взаимодействия являются бобовые ра˝с- тения, которые выделяют в ризосферу корней вещества фенол˝ь-

ной природы — специфические флавоноиды. Под действием ф˝лавоноидов в клетках бактерий инициируется синтез так назы˝вае-

мых Nod-факторов, представляющих собой олигосахариды из 3—6

остатков N-ацетилглюкозамина, соединенные через атом азот˝а с

радикалом ненасыщенной жирной кислоты (специфичной для

каждого вида растений). В свою очередь, бактериальные Nod-фак˝- торы оказывают воздействие на клетки корневых волосков б˝обо-

вого растения, вызывая деформацию клеточной стенки и плаз˝ма-

леммы.

Âрезультате взаимодействия мембранных структур растит˝ель-

ной и бактериальной клеток формируется особая структура˝ — инфекционная нить, которая проникает в кортикальные клетки˝ кор-

ня и инициирует там образование мембран, отделяющих бакте˝ри-

альные клетки от цитоплазмы клеток растения, формирующих˝

ткани клубеньков.

Бактериальные клетки в клубеньках увеличиваются в разме˝рах

èпревращаются в особые структуры, предназначенные для аз˝от-

фиксации, — бактероиды. В них синтезируются ферментные систе-

мы нитрогеназы, электронтранспортной цепи синтеза АТФ, фер-

менты, катализирующие реакции цикла Кребса, а также осуще˝-

ствляющие транспорт в бактероид растительных метаболит˝ов и выводящие из него в растительную клетку продукты восстан˝овления молекулярного азота. Общая схема функционирования фе˝р-

ментных систем бактероида в клубеньках бобовых растений˝ представлена на рисунке 11.1.

Âбактероидах основной источник электронов и энергии для˝ восстановления молекулярного азота — реакции цикла Кре˝бса,

субстратами для которых служат главным образом дикарбоновые

кислоты (янтарная и яблочная), поступающие в бактероид из ˝цитоплазмы растительной клетки. Указанные субстраты, питаю˝щие бактероид, образуются в клетках клубеньков из фотоассими˝лятов растения по известным нам механизмам в соответствии со сл˝еду-

ющей схемой:

Далее фосфоенолпировиноградная кислота под действием фосфоенолпируваткарбоксилазы превращается в щавелевоуксусную

459

Ìеìбраíа бакòерîиäа

Рис. 11.1. Схема биохимических процессов, происходящих в бак˝тероидах клубеньков бобовых растений:

ПВК — пировиноградная кислота; Фд — ферредоксин

кислоту, которая с участием малатдегидрогеназы восстанавливает-

ся затем в яблочную кислоту:

Âмембране, окружающей бактероид, локализованы также ферменты, катализирующие превращение яблочной кислоты в˝

янтарную.

Âходе реакций цикла Кребса, происходящих в бактероиде, си˝н-

тезируются восстановленные динуклеотиды НАД · Н и ФАД ˝· Н,

2

которые служат донорами электронов для электронтранспо˝ртной

цепи системы окислительного фосфорилирования, обеспечи˝ваю-

460