Экспрессия генов Патрушев

81

получила название индуцированной, или активированной. Следовательно, базальная транскрипция не может происходить in vivo, и этот термин используется только при описании результатов исследований синтеза РНК in vitro, в бесклеточных системах транскрипции.

Рис. I.6. Цикл транскрипции и последующие пути реализации генетической информации

Связывание молекул РНК-полимеразы с ДНК и поиск промоторов.

Механизм поиска промоторов на ДНК молекулами РНК-полимеразы в настоящее время до конца не выяснен. Принято считать, что после первоначального непрочного связывания с ДНК в случайных местах молекулы РНК-полимеразы перемещаются вдоль двойной спирали ДНК до тех пор, пока не обнаруживают последовательности нуклеотидов промоторов, на которых взаимодействие фермента с ДНК становится более прочным. Во время движения молекулы РНК-полимеразы могут периодически отделяться от ДНК и связываться с ней на новом месте, что ускоряет процесс поиска промоторов. Как уже упоминалось выше, в связывании с ДНК участвует β-субъединица РНК-

полимеразы E. coli, а α- и особенно σ-субъединицы необходимы для специфического распознавания промоторов. Установлено, что холофермент РНК-полимеразы E. coli (минимальный фермент, содержащий σ-субъединицу)

82

закрывает в области промотора участок ДНК длиной ~50 п.о. При этом α-

субъединицы контактируют с ДНК в области −35-го нуклеотида промотора. Инициация транскрипции. Инициация транскрипции начинается со

сборки на промоторе прединициационного комплекса, в состав которого входят молекулы РНК-полимеразы и матричной ДНК. Если в случае РНК-полимеразы E. coli и других прокариот для осуществления этого процесса нет необходимости в присутствии других белковых факторов, то механизм сборки инициационного комплекса с участием РНК-полимеразы II носит более сложный характер. В настоящее время существуют две модели инициации транскрипции РНК-полимеразой II. В соответствии с одной из них на промоторе происходит постепенная (ступенчатая) сборка инициационного комплекса из отдельных компонентов. Другая модель акцентирует внимание на то, что Pol II может входить в состав инициационного комплекса в виде холофермента, состоящего из многих субъединиц. Хотя вторая модель становится доминирующей, ниже будет подробнее рассмотрена первая модель, более наглядно описывающая процесс инициации транскрипции у эукариот.

Сборка такого комплекса начинается с последовательного связывания с промотором основных факторов транскрипции (табл. I.4). Обычно факторами транскрипции называют белки или белковые комплексы, непосредственно не участвующие в каталитическом акте образования РНК, но необходимые для прохождения основных этапов транскрипции и ее регуляции. По функциональному признаку принято различать три класса факторов транскрипции. К первому классу относятся основные факторы транскрипции, обеспечивающие нерегулируемый базальный уровень транскрипции и функционирующие в клетках всех типов.

83

Таблица I.4

Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (GTF) РНК-полимеразы II человека

84

85

Рис. I.7. Схема инициации транскрипции РНК-полимеразой II и освобождения промотора

а – сборка прединициационного транскрипционного комплекса; б – инициация транскрипции и освобождение промотора

Ко второму классу относятся факторы транскрипции, специфически взаимодействующие с определенными последовательностями ДНК, которые являются основными регуляторами транскрипции и обеспечивают тканеспецифическую экспрессию генов. И, наконец, третий класс факторов транскрипции (в том числе многочисленные TAF-белки (TAB-associated factors)) представлен недавно открытыми белками – коактиваторами транскрипции, которые действуют согласованно с основными и тканеспецифическими

86

факторами, обеспечивая более тонкую регуляцию транскрипции. О двух последних классах факторов транскрипции речь пойдет в разделе 3.2.2.

Первым с TATA-последовательностью промотора взаимодействует белковый комплекс TFIID (transcription factor II D), в состав которого входят белок, связывающий TATA-последовательность (TBP), а также еще по меньшей мере девять белковых субъединиц (см. рис. I.7,а). Белок TBP необходим и для осуществления транскрипции РНК-полимеразами I и III, он является универсальным фактором транскрипции у эукариот. Взаимодействие TBP с TATA-последовательностью характеризуется значительным изменением структуры ДНК в этом месте, сопровождаемым частичным разворачиванием двойной спирали. После взаимодействия с TATA-последовательностью TFIID приобретает способность ассоциироваться с факторами TFIIA и TFIIB. Присутствие TFIIB делает возможным вхождение РНК-полимеразы II в прединициационный комплекс. Присоединение РНК-полимеразы II к комплексу сопровождается связыванием с ней дополнительных факторов TFIIE, TFIIF, TFIIH и TFIIJ, что завершается образованием так называемого закрытого прединициационного комплекса (см. рис. I.7,б). Свое название комплекс получил благодаря тому, что участок ДНК промотора, входящий в его состав, в основном сохраняет свою исходную вторичную структуру – обе цепи ДНК связаны друг с другом водородными связями. В инициационном комплексе происходит локальное плавление, т.е. раскрытие соответствующего участка ДНК, и комплекс становится способным к инициации транскрипции. Аминокислотные последовательности отдельных субъединиц факторов TFIIB, TFIIE и TFIIF обнаруживают явную гомологию с последовательностями σ70фактора РНК-полимеразы E. coli. Это может указывать на определенную общность функций и эволюционного происхождения про- и эукариотических факторов транскрипции.

После сборки прединициационный закрытый комплекс претерпевает температурно-зависимые конформационные изменения, что необходимо для образования активного инициирующего транскрипционного комплекса. Показано, что в закрытом комплексе холофермент РНК-полимеразы E. coli взаимодействует с молекулой ДНК лишь с одной ее стороны, тогда как в промежуточном и открытом комплексах β- и β‘-субъединицы РНК-полимеразы полностью охватывают молекулу ДНК в окрестностях точки инициации

87

транскрипции. Конформационный переход промежуточного прединициационного комплекса в открытый сопровождается локальным плавлением двойной спирали ДНК между нуклеотидами в положениях −10 и +3 с образованием коротких одноцепочечных участков ДНК. При наличии открытого инициационного комплекса в присутствии четырех рибонуклеозидтрифосфатов может происходить инициация транскрипции, сопровождаемая синтезом коротких (до 7–8 нуклеотидов) олигорибонуклеотидов, непрерывно освобождающихся из транскрипционного комплекса в том случае, если синтез РНК не может быть продолжен (например из-за отсутствия очередного нуклеотида). Эта стадия синтеза РНК получила название абортивной транскрипции. После синтеза РНК длиной более девяти нуклеотидов фермент покидает промотор, у РНК-полимеразы E. coli происходит отделение σ-фактора от инициационного комплекса, формируется стабильный элонгирующий комплекс, и реакция транскрипции вступает в фазу элонгации.

Фаза абортивной транскрипции характерна для прокариотических и эукариотических РНК-полимераз. Однако переход от стадии абортивной транскрипции к продуктивной элонгации у эукариот характеризуется рядом особенностей. В отличие от РНК-полимеразы E. coli (а также эукариотических РНК-полимераз I и III), РНК-полимераза II содержит в С-концевом домене большой субъединицы гексапептидный повтор (до 52 повторяющихся последовательностей) CTD (carboxy terminal domain), который является субстратом протеинкиназы. В прединициационном комплексе эта последовательность аминокислотных остатков частично фосфорилирована, тогда как у активно элонгирующей РНК-полимеразы CTD фосфорилирован полностью по остаткам Ser и Thr. Несмотря на то, что in vitro многие протеинкиназы обладают способностью фосфорилировать CTD, биологические функции в данном процессе приписывают протеинкиназе фактора TFIIH. Дополнительные исследования показали, что эта протеинкиназа идентична киназе cdk7, участвующей в регуляции клеточного цикла. Предполагается, что in vivo частичное фосфорилирование CTD-домена удерживает молекулу РНКполимеразы II на промоторе, и его полное фосфорилирование необходимо для того, чтобы фермент покинул промотор и перешел к элонгации вновь синтезируемых цепей РНК. Этот процесс получил название "освобождение промотора" (promoter clearance (escape)) (см. рис. I.7,б). Кроме того, переход

88

закрытого прединициационного комплекса, образованного РНК-полимеразой II,

воткрытый инициационный комплекс является ATP-зависимым процессом.

Взаключение необходимо еще раз вспомнить о том, что многие клеточные белки могут выполнять более одной функции, что является основой тесного сопряжения биохимических реакций, вовлеченных в процессы реализации генетической информации. В частности, многие (пять из девяти) субъединицы TFIIH служат основными компонентами системы эксцизионной репарации ДНК (см. табл. I.4, а также раздел 5.2.2). Такое сопряжение приводит к более эффективной репарации повреждений ДНК в активно транскрибируемых генах по сравнению с молчащими последовательностями ДНК.

Элонгация цепей РНК. Момент перехода РНК-полимеразы от инициации транскрипции к элонгации точно не определен. Три основных биохимических события характеризуют этот переход в случае РНК-полимеразы E. coli: отделение σ-фактора, первая транслокация молекулы фермента вдоль матрицы и сильная стабилизация транскрипционного комплекса, который кроме РНК-полимеразы включает растущую цепь РНК и транскрибируемую ДНК. Все те же явления характерны и для РНК-полимераз эукариот, хотя в этом случае момент перехода от инициации к элонгации еще более неопределенен. И в том, и в другом случае переход от инициации к элонгации сопровождается разрывом связей между ферментом, промотором, факторами инициации транскрипции, а в ряде случаев – переходом РНК-полимеразы в состояние компетентности в отношении элонгации (например фосфорилирование CTDдомена у РНК-полимеразы II). Фаза элонгации заканчивается после освобождения растущего транскрипта и диссоциации фермента от матрицы (терминация).

Биохимические особенности элонгации. РНК-полимеразы являются процессивными ферментами: если фермент освобождает растущую цепь РНК до завершения транскрипции гена, то он не в состоянии связать эту РНК вновь и продолжить транскрипцию. Поэтому каждый новый раунд синтеза РНК начинается с реинициации транскрипции на промоторе. Такие биохимические особенности РНК-полимераз объясняют, почему стабильность транскрибирующего комплекса является одним из его критических свойств.

90

– ДНК-связывающий центр I; С–D – расстояние между 3′-концом РНК и передней границей РНК-полимеразы (п.о.)

Действительно, многие гены эукариот обладают очень большими размерами (длина гена дистрофина человека, например превышает 2000 т.п.о. и его транскрипция продолжается 17 ч), следовательно, преждевременная терминация транскрипции могла бы с большой вероятностью прекратить экспрессию таких генов вообще. Из этих соображений не удивительно, что тройной комплекс РНК-полимераза–РНК–матрица чрезвычайно стабилен. Такие комплексы устойчивы к высокой ионной силе, допускают очистку гельфильтрацией, преципитацию антителами, остаются активными после проведения электрофореза в неденатурирующих условиях и могут храниться в отсутствие рибонуклеозидтрифосфатов при +4оС в течение нескольких дней без потери активности.

В настоящее время разработаны методы, позволяющие задерживать элонгирующую РНК-полимеразу бактерий в любом участке матрицы путем удаления из реакционной смеси одного из рибонуклеозидтрифосфатов. При таком подходе РНК-полимеразу иммобилизуют на носителе, и процесс транскрипции осуществляют непосредственно в колонке, последовательно добавляя нуклеотид за нуклеотидом после отмывания предыдущего. Это дает возможность последовательно перемещать РНК-полимеразу от одного нуклеотида к другому вдоль матрицы, как бы шагать вдоль матричной ДНК (walking). Такой метод является прекрасным инструментом для исследования механизмов элонгации и обнаружения факторов транскрипции, оказывающих влияние на этот процесс.

Скорости транскрипции матричной ДНК РНК-полимеразами сильно различаются. Обнаружена слабая корреляция между субъединичным строением РНК-полимераз и скоростью, с которой они способны элонгировать ДНК. Так, РНК-полимеразы бактериофагов, состоящие из одной субъединицы, являются наиболее быстрыми среди ДНК-зависимых РНК-полимераз. Они способны элонгировать in vitro растущую цепь РНК со скоростью 200–400 нт/с. Бактериальные РНК-полимеразы транскрибируют ДНК с промежуточной скоростью – 50–100 нт/с, тогда как скорость элонгации РНК-полимеразой II многоклеточных организмов in vitro составляет всего 5–10 нт/с. Эукариотические РНК-полимеразы элонгируют цепи РНК in vivo со скоростью