Экспрессия генов Патрушев

221

Генетическая информация хпДНК во многих случаях редактируется на уровне мРНК (подробно о механизме см. раздел 2.2.2). В этом случае в результате запрограммированных замен нуклеотидов в мРНК происходит создание новых инициирующих и терминирующих кодонов, а также изменение их смысла. Лишь очень редко редактирование сопровождается синонимическими заменами нуклеотидов (без изменения смысла кодона). Редактирование является критическим событием в экспрессии генов хлоропластов, так как неотредактированные транскрипты не способны правильно транслироваться. Очень эффектным результатом редактирования предшественника мРНК хлоропластов является создание в результате двух замен нуклеотидов инициирующего и терминирующего кодонов с образованием новой открытой рамки считывания, т.е. фактически нового гена, посттранскрипционно. В хлоропластах кукурузы, табака и черной сосны, геномы которых полностью секвенированы, имеется соответственно 26, 32 и 26 сайтов редактирования.

Зрелые и функционально активные мРНК хлоропластов не обладают кэпгруппами и не полиаденилированы на 3'-концах. Из 70 генов, кодирующих белки в хлоропластах табака, лишь пять транскрибируются моноцистронно. Полицистронные предшественники мРНК подвергаются эндонуклеазному процессингу с образованием моноцистронных матриц. Более того, искусственные дицистронные мРНК не транслируются в бесклеточных системах. На этом основании делается вывод, что в хлоропластах в синтезе белка участвуют моноцистронные мРНК.

Среди 79 исследованных генов, кодирующих белки в хлоропластах табака, 30 содержат SD-подобные последовательности в 20-нуклеотидном участке перед инициирующим кодоном. Остальные 49 транскриптов также содержат такие последовательности, но их положение не фиксировано на матрице. Мутационные изменения некоторых SD-подобных последовательностей снижают эффективность трансляции мутантных мРНК, что указывает на функциональную значимость этих участков мРНК. Детальное исследование 5'UTR мРНК гена psbA хлоропластов табака позволило идентифицировать цис-действующие регуляторные элементы, существенные для ее трансляции. Два из них – RBS1 (AAG) и RBS2 (UGAU), расположенные между нуклеотидами в положениях –11 и –9, –25 и –22 соответственно

222

комплементарны 3'-концу 16S рРНК хлоропластов. Полагают, что они участвуют во взаимодействии 30S субчастицы рибосом с мРНК. AU-богатая последовательность, расположенная между ними (UAAAUAAA) и получившая название AU-бокса, также критична для трансляции. Возможно, с этой последовательностью взаимодействуют транс-действующие белковые факторы. На наличие таких факторов трансляции указывают многочисленные данные мутационного анализа Chlamydomonas.

Как и у бактерий, AUG является основным инициирующим кодоном мРНК хлоропластов и направляет включение в полипептидную цепь формилметионина. Информация о молекулярных механизмах отдельных этапов трансляции в хлоропластах еще не получена.

223

ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ ПУТИ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ

В этой главе будет рассмотрена лишь небольшая часть той почти необъятной информации, которая накоплена к настоящему времени в отношении механизмов регуляции экспрессии генов.

Конечным результатом экспрессии любого известного гена на молекулярном уровне является образование молекул РНК или белка, информация о первичной структуре которых закодирована в этом гене. Процесс биосинтеза белка складывается из многих взаимосвязанных этапов. Как уже упоминалось выше, основными из них являются транскрипция, трансляция, а также посттранскрипционные и посттрансляционные процессинг и модификации РНК и белка. Поэтому изменение скорости протекания каждого из данных этапов сопровождается, в конечном счете, изменением внутриклеточного содержания функционально активного продукта экспрессии гена. Следовательно, регуляторное воздействие на любом из этих этапов может привести к изменению уровня экспрессии соответствующего гена в клетках. Регулируемая экспрессия генов предполагает высокоспецифическое изменение внутриклеточного содержания кодируемых этими генами белков и нуклеиновых кислот в ответ на действие продуктов экспрессии других генов или регуляторных сигналов внутри- и внеклеточного происхождения, например низкомолекулярных метаболитов, ксенобиотиков или физических факторов (температура, ионизирующее излучение и т.п.). Избирательность таких воздействий становится возможной благодаря образованию высокоспецифических белок–белковых комплексов, комплексов лиганд– рецептор, распознаванию белками определенных последовательностей нуклеотидов ДНК или РНК, а также вследствие комплементарных взаимодействий нуклеиновых кислот друг с другом.

Избирательное действие низкомолекулярных биорегуляторов на гены происходит опосредованно через соответствующие рецепторы белковой природы. При этом, как правило, реализуется следующая схема: высокоили низкомолекулярный эффектор (лиганд) специфически связывается с регуляторным белком-рецептором (например репрессором или активатором гена), изменяя конформацию рецептора таким образом, что он приобретает

224

способность распознавать регуляторные последовательности нуклеиновых кислот или других регуляторных белков. Подобные взаимодействия, происходящие на одном из вышеупомянутых этапов биосинтеза белка, далее сопровождаются изменением эффективности экспрессии его гена. Очевидно, что наиболее продуктивно можно оказывать влияние на экспрессию гена через его транскрипцию. При таком способе регуляции должен изменяться внутриклеточный уровень соответствующих мРНК, который может лимитировать биосинтез белков рибосомами. Кроме того, прекращение синтеза мРНК для уменьшения внутриклеточного содержания ненужных в данный момент белков экономично и с энергетической точки зрения, так как с прекращением транскрипции перестает затрачиваться энергия на биосинтез ненужных макромолекул – мРНК или их предшественников. Действительно, регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции широко распространена в природе.

Однако этот способ не является единственным. В ряде случаев накопление мРНК в виде внутриклеточного пула без немедленной их трансляции происходит перед определенными стадиями дифференцировки клеток, например в яйцеклетках до оплодотворения. Эти неактивные мРНК могут длительное время храниться и немедленно использоваться после получения клетками соответствующих сигналов. Кроме того, альтернативный процессинг мРНК приводит к образованию из одного и того же предшественника нескольких зрелых мРНК, трансляция которых сопровождается синтезом разных белковых продуктов. Специальные регуляторные механизмы могут изменять соотношения таких процессированных мРНК и, как следствие, внутриклеточное содержание кодируемых ими полипептидов. Использование регуляции данного типа позволяет повысить кодирующие возможности генов путем более сжатого хранения генетической информации. Не меньшую пользу для клетки приносит и регуляция экспрессии генов на других уровнях: трансляционном и посттрансляционном, которые только в совокупности способны обеспечивать поддержание жизненно важного гомеостаза организма.

Это краткое резюме, в котором перечислены основные пути регуляции экспрессии генов на качественном уровне, подразумевает количественные изменения внутриклеточного содержания белков и РНК, закодированных в

225

геноме живого организма, в ответ на соответствующие регуляторные воздействия. Представляется весьма желательным построение количественных моделей регуляции активности генов. Такая постановка вопроса особенно актуальна с учетом тех глубоких перестроек фенотипа, которые сопровождают количественные изменения внутриклеточных концентраций продуктов конкретных генов (например в результате нарушения дозовой компенсации), в ряде случаев приводящие к развитию тяжелейших заболеваний (в частности синдрому Дауна).

3.1. Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот

Регуляция транскрипции в клетках осуществляется на уровне индивидуальных генов, их блоков и даже целых хромосом. Возможность управления многими генами, как правило, обеспечивается наличием у них общих регуляторных последовательностей нуклеотидов, с которыми взаимодействуют однотипные факторы транскрипции. В ответ на действие специфических эффекторов такие факторы приобретают способность с высокой точностью связываться с регуляторными последовательностями генов. Следствием этого является ослабление или усиление транскрипции (репрессия или активация) соответствующих генов.

Три основных этапа транскрипции – инициация, элонгация и терминация, рассмотренные нами выше, используются бактериальными клетками для регуляции синтеза РНК. То же, по-видимому, характерно и для остальных живых организмов. Ниже приведены примеры регуляторных воздействий на транскрипцию.

3.1.1. Регуляция на уровне инициации транскрипции

Активность многих генов прокариот регулируется с помощью белковых факторов, взаимодействующих с регуляторными участками промоторов генов. При этом происходят как активация транскрипции генов, так и подавление считывания генетической информации РНК-полимеразами. В первом случае регуляторные белковые факторы называют активаторами, осуществляющими позитивную регуляцию транскрипции, а во втором – репрессорами. Регуляцию, связанную с подавлением транскрипции, называют негативной.

226

Механизмы, при помощи которых активаторы стимулируют инициацию транскрипции, могут быть рассмотрены с двух точек зрения – кинетической и структурной. Поскольку активация промоторов путем образования открытых комплексов является лимитирующей стадией на пути активации транскрипции в целом, действие различных активаторов может быть охарактеризовано по изменению (увеличению) значений кинетических параметров реакций, происходящих на разных этапах активации. Так, при действии активирующего комплекса Crp–cAMP на lac-промотор происходит десятикратное увеличение равновесной константы ассоциации KB РНК-полимеразы с промотором с образованием закрытого комплекса. Активация промотора PRM фага λ, опосредованная cI-белком (см. ниже), характеризуется пяти–десятикратным увеличением константы скорости kf перехода закрытых комплексов в открытые. Активирующее действие белка λ-cII на промотор РRE сопровождается изменением обоих вышеупомянутых кинетических параметров. Активация транскрипции может быть также опосредована увеличением скорости освобождения промотора РНК-полимеразой после инициации синтеза РНК.

Многие активаторы транскрипции, в том числе и Crp–cAMP, сгибают молекулу ДНК после взаимодействия с ней, причем центр такого изгиба находится в сайте связывания активатора. Однако с использованием мутантных белков было установлено, что изгибание ДНК и связывание активаторов с ДНК как таковое еще не обеспечивают активацию транскрипции. В большинстве случаев абсолютно необходимым условием активации является наличие контакта между специфическими областями поверхностей молекул активатора и РНК-полимеразы, часто с ее α-субъединицами. Важным следствием образования контактов между активаторами и холоферментом РНК-полимеразы является часто наблюдаемый синергизм в связывании обоих белков с соответствующими промоторами. При этом мутации в сайтах связывания активаторов или промоторе как таковом могут предотвращать активацию транскрипции путем изменения конформации молекулы связанного активатора или контактного участка на РНК-полимеразе.

Последовательности нуклеотидов промоторных участков генов, с которыми взаимодействуют молекулы репрессора, получили название операторов. Во многих случаях репрессор связывается с оператором только в

227

присутствии низкомолекулярного лиганда, специфически взаимодействующего с репрессором. Такие низкомолекулярные эффекторы получили название корепрессоров. Они часто требуются и для функционирования белковактиваторов транскрипции. Простейший механизм репрессии заключается в стерическом блокировании связывания РНК-полимеразы с промотором. Это происходит в том случае, если последовательности нуклеотидов мест посадки РНК-полимеразы на промотор и репрессора на оператор перекрываются.

Некоторые бактериальные белки-репрессоры могут оказывать свое негативное действие на этапы инициации, происходящие после связывания РНК-полимеразы с промотором. Например, молекулы репрессора gal-оперона E. coli, связавшиеся с операторами OE и OI, центры последовательностей которых расположены соответственно на расстояниях –60,5 и +53,5 по отношению к точке инициации транскрипции, вызывают образование петли участка ДНК, заключенного между ними, но не препятствуют взаимодействию РНК-полимеразы с промотором. Они оказывают свое действие на последующие этапы инициации, предшествующие образованию первой фосфодиэфирной связи. В том случае, если лишь одна молекула репрессора связывается с внешним оператором OE, он частично ингибирует транскрипцию путем взаимодействия с α-субъединицей РНК-полимеразы. Это сопровождается понижением уровня, но не полным прекращением синтеза РНК gal-оперона, т.е. более тонким изменением уровня экспрессии соответствующих генов.

Распространенным механизмом активации транскрипции с помощью белков-активаторов является облегчение ее инициации РНК-полимеразой после образования контакта между ферментом и белком-активатором, связанными с регуляторной областью промотора, что сопровождается конформационными изменениями РНК-полимеразы. У бактерий имеются белкирегуляторы, обладающие активностью как репрессора, так и активатора транскрипции. Такими "амфотерными" свойствами обладает, в частности, репрессор cI фага λ. Белок-активатор катаболитных оперонов (Crp-белок) активирует транскрипцию бактериальных генов, продукты которых участвуют в расщеплении (катаболизме) различных органических соединений (преимущественно сахаров), используемых растущей бактериальной клеткой в качестве источника углерода. Свои свойства активатора Crp-белок приобретает лишь в комплексе с циклическим AMP (сAMP). Внутриклеточная концентрация

228

сAMP возрастает у бактерий, растущих на бедных питательных средах, и понижается в условиях избытка легко усвояемых источников углерода, например глюкозы. Поэтому система Crp–сAMP обеспечивает включение экспрессии катаболитных оперонов лишь на бедных питательных средах. Crpбелок может выступать и в роли репрессора транскрипции генов галактозного оперона E. coli. Если все гены катаболитных оперонов активируются Crpбелком в присутствии сAMP, то негативная регуляция их транскрипции происходит индивидуально. Хорошо известными примерами такого рода являются регуляции транскрипции lac-оперона E. coli под действием Lacрепрессора, а также галактозного и арабинозного оперонов специфическими белками-репрессорами этих оперонов.

Низкомолекулярные эффекторы могут изменять активность РНКполимеразы не только опосредованно через белки-регуляторы, но и непосредственно при взаимодействии с ферментом. С помощью гуанозинтетрафосфата (ppGpp) в клетках E. coli осуществляется координация экспрессии генов рибосомных РНК (рРНК) и белков. Этот необычный нуклеотид (известный также под названием "магического пятна") синтезируется бактериальными клетками в условиях внутриклеточного недостатка аминокислот, что приводит к значительному снижению интенсивности транскрипции генов рРНК и белков и одновременной стимуляции синтеза РНК оперонов, контролирующих биосинтез аминокислот. В присутствии ppGpp очищенная РНК-полимераза прекращает синтез рРНК с одного из двух промоторов этих оперонов, что приводит к ослаблению, но не полному прекращению их транскрипции. Известны мутации, локализованные в гене β- субъединицы РНК-полимеразы E. coli, приводящие к прекращению влияния ppGpp на синтез РНК, что подтверждает наличие непосредственного контакта между нуклеотидом и ферментом в процессе транскрипции.

Некоторые регуляторные элементы бактерий, участвующие в активации транскрипции, так же как и энхансеры эукариот (см. раздел 3.2.2), могут располагаться на большом расстоянии (нескольких сотен нуклеотидов) от промоторов, на которые они оказывают свое действие. В этом случае контакт активатора с РНК-полимеразой обеспечивается благодаря выпетливанию участка ДНК, расположенного между данными регуляторными элементами, что приводит к пространственному сближению двух белков. Прямое доказательство

229

образования таких петель на ДНК E. coli было, в частности получено с помощью электронной микроскопии для белков NtrC и NifA, действующих соответственно на промоторы генов glnA и nifH. Другим путем достижения белком-активатором молекулы РНК-полимеразы на удаленном промоторе (например промоторе поздних генов бактериофага Т4) является его перемещение вдоль отрезка ДНК, разделяющего эти два регуляторных элемента. Процесс такого перемещения может быть инициирован последовательностями нуклеотидов, расположенными выше или ниже промотора на расстоянии нескольких сотен пар оснований.

Одним из давно обсуждающихся вопросов является необходимость изменения структуры ДНК в окрестностях промоторов под действием белковактиваторов для активации транскрипции. В ряде случаев такие доказательства были получены. Так, в mer-локусе E. coli, обеспечивающем устойчивость бактериальных клеток к ионам ртути, связывание Mer-белка с регуляторным участком промотора (merT) в присутствии ртути сопровождается раскручиванием спирали ДНК в районе промотора на 50о. Это приводит к образованию правильного расстояния между сайтами связывания активатора и промотором, так как первый расположен необычно – между нуклеотидами в положениях –35 и –10 промотора. Без такого изменения структуры ДНК связавшийся с ним активатор не может образовать правильного контакта с РНК-полимеразой.

В заключение этого раздела следует еще раз подчеркнуть, что у активируемых бактериальных промоторов образование открытых комплексов в отсутствие активаторов является лимитирующей стадией при инициации транскрипции. Первичная структура активируемых промоторов весьма слабо соответствует каноническим структурам. При этом мутации, обеспечивающие функционирование таких промоторов без активации, увеличивают скорость образования открытых комплексов РНК-полимеразой.

3.1.2. Регуляция синтеза РНК на уровне элонгации и терминации

Выше было отмечено, что РНК-полимераза в процессе элонгации цепей РНК перемещается неравномерно вдоль матричной ДНК и во время ее движения имеют место остановки (паузы). Время задержки молекул РНК-

230

полимеразы в определенных участках транскрибируемых генов меняется под действием различных белковых факторов. При этом эффективность транскрипции соответствующих фрагментов ДНК зависит от последовательностей нуклеотидов, окружающих транскрибируемые участки генов.

Основная регуляторная роль терминаторов транскрипции заключается в прекращении синтеза РНК на границе гена и освобождении полученной РНК из транскрипционного комплекса. Механизмы функционирования терминаторов уже были кратко рассмотрены в разделе, посвященном транскрипции. Однако терминаторы встречаются не только на границах одиночных генов, но и в конце генов, входящих в состав оперонов. Эффективность терминации транскрипции на таких внутренних терминаторах может регулироваться, что сопровождается изменением скорости синтеза РНК на последовательностях нуклеотидов оперонов, расположенных за терминаторами.

Функционирование аттенюаторов – регулируемых терминаторов транскрипции бактерий, которые были рассмотрены в разделе 2.1.3, сопряжено с синтезом лидерного пептида рибосомами. Этот тип регуляции используется грамотрицательными бактериями для изменения уровня транскрипции многих оперонов, контролирующих биосинтез аминокислот. Как уже упоминалось, отличительной чертой такого типа регуляции является образование альтернативных вторичных структур РНК, которые формируются под влиянием рибосом, прекращающих трансляцию на кодонах аминокислот, которые клеткам необходимо синтезировать. В дополнение к этому, как прокариоты, так и эукариоты обладают способностью реагировать на многие внеклеточные и внутриклеточные процессы изменением скорости элонгации транскриптов.

Влияние условий роста бактериальных клеток на элонгацию цепей РНК. Механизмы преждевременной терминации транскрипции и антитерминации интенсивно используются бактериями для регуляции внутриклеточного метаболизма при изменении условий роста клеток. В частности, скорости синтеза рРНК и тРНК строго координированы со скоростью роста, и наоборот, число делений клеток в единицу времени прямо зависит от скорости транскрипции соответствующих оперонов. Совокупность событий, развивающихся у бактерий в ответ на изменение скорости их роста, например при изменении содержания питательных веществ в среде, получила название