Экспрессия генов Патрушев

121

промоторе была обнаружена последовательность длиной в 200–300 нуклеотидов с повышенной чувствительностью к ДНКазе, в состав которой входят TATA-бокс и сайты связывания факторов GAGA и HSF (heat shock factor

– фактор теплового шока). Гиперчувствительность промотора к действию ДНКазы можно было моделировать в бесклеточных экстрактах как до, так и после сборки хроматина путем добавления GAGA-фактора и ATP. Поскольку фактор GAGA сам по себе не обладает ATPазной активностью, в результате очистки белков с этой активностью и был идентифицирован комплекс NURF. Этот комплекс может разрушать нуклеосомы или изменять их положение в промоторе гена HSP70 и в отсутствие фактора GAGA. Однако присутствие NURF стимулирует связывание этого фактора со своим сайтом на промоторе, что, в свою очередь, ускоряет перестройку нуклеосом в этом участке гена. ATPазная активность NURF не стимулируется свободной ДНК или гистонами, однако усиливается в присутствии интактных нуклеосом, что отличает этот фермент от ATPазы Swi2. При микросеквенировании пептида с молекулярной массой 140 кДа в нем был обнаружен ATPазный домен, гомологичный таковому Swi2, однако это оказалось единственной гомологией между двумя комплексами. Следует еще раз подчеркнуть, что отсутствие у них общих субъединиц и существенной гомологии указывает на возможность независимого функционирования этих комплексов и действия на разные субстраты.

Специфичность функционирования ATP-зависимых белковых комплексов, изменяющих структуру нуклеосом, предполагает их точную доставку в нужные места хроматина. Как и в уже рассмотренном случае ацетилаз и деацетилаз гистонов, специфический характер взаимодействия комплексов с ДНК обеспечивается дополнительными белками. Выше упоминалось о том , что комплекс Swi/Snf входит в состав холофермента РНКполимеразы II, что обеспечивает его доставку к соответствующим промоторным последовательностям. Кроме того, было показано, что этот комплекс может взаимодействовать с рецептором глюкокортикоидов и в таком виде оказывать влияние на структуру нуклеосом. Формирование таких комплексов, повидимому, является одним из существенных моментов активации рецепторов глюкокортикоидов. Учитывая обсуждавшееся выше взаимодействие рецепторов стероидных гормонов с ацетилазами/деацетилазами гистонов, можно полагать,

122

что специфическое изменение структуры хроматина является общим механизмом, посредством которого рецепторы оказывают влияние на экспрессию соответствующих генов.

Нуклеосомы при элонгации синтезируемой РНК. Механизмы,

обеспечивающие элонгацию транскрипции на нативном хроматине, не совсем понятны. Поскольку РНК-полимеразы прокариот, в частности фагов SP6 и T7, обладают способностью транскрибировать хроматин in vitro, создавалось впечатление, что для прохождения РНК-полимеразами нуклеосом хроматина во время элонгации РНК не требуются дополнительные факторы. Тем не менее, нуклеосомы ингибируют транскрипцию хроматина in vitro на стадии элонгации эукариотическими РНК-полимеразами II и III, что не наблюдается in vivo. Одной из гипотез, объясняющих процесс элонгации транскрипции на хроматине,

является модель двойных суперскрученных доменов. В соответствии с этой моделью предполагается, что транскрибирующая РНК-полимераза индуцирует в ДНК образование локальных суперскрученных доменов. Положительные супервитки образуются впереди элонгирующей РНК-полимеразы, а отрицательные – позади фермента. Закручивание ДНК вокруг гистонового октамера в нуклеосоме приводит к незначительным изменениям в параметрах двойной спирали ДНК и к образованию одного отрицательного супервитка в молекуле ДНК. Его формирование должно приводить к компенсаторной положительной сверхспирализации участков ДНК, прилегающих к нуклеосоме. Образование нуклеосом осуществляется предпочтительно на отрицательно сверхспирализованной ДНК, а ее положительная сверхспирализация сопровождается ослаблением структуры нуклеосом или их разрушением в присутствии дополнительных белковых факторов. Эти факты и лежат в основе обсуждаемой модели.

Таким образом, в соответствии с этой моделью, элонгирующая РНКполимераза индуцирует впереди себя локальную положительную сверхспирализацию молекулы ДНК, что облегчает разрушение нуклеосом, находящихся в этой зоне. Повторное образование нуклеосом происходит в зоне отрицательно сверхспирализованной ДНК позади транскрибирующей РНКполимеразы.

Конвергентный характер исследований функциональной структуры хроматина и транскрипции лишь иллюстрирует общую тенденцию развития

123

современной молекулярной биологии и генетики. Чем глубже становится понимание механизмов функционирования отдельных генетических систем клетки, тем яснее видится их взаимозависимость и полифункциональность. Высокоупорядоченные перестройки нуклеосом и хроматина сопровождают не только транскрипцию, но и репликацию, рекомбинацию и репарацию повреждений ДНК. В связи с этим проблема структуры хроматина и динамики ее изменений в клеточном цикле является одной из центральных в современной молекулярной генетике.

Концепция транскриптосомы. Как было показано выше,

транскрипционный комплекс, в состав которого входит эукариотическая РНКполимераза II, устроен весьма сложно. Появляется все больше данных в пользу того, что транскрипционный комплекс взаимодействует с другими крупными белковыми комплексами, участвующими, в частности, в разрушении нуклеосом и репарации ДНК. Полный размер образующегося при этом стабильного транскрипционного комплекса, содержащего более 70 полипептидов, приближается к размеру рибосомы. Такой колоссальный размер транскрипционного комплекса эукариот, вероятно, должен замедлять поиск путем линейной диффузии регуляторных последовательностей нуклеотидов транскрибируемой ДНК, на которых происходит инициация транскрипции. Обсуждается возможность того, что инициация транскрипции у эукариот осуществляется в специализированных надмолекулярных комплексах, специфически ассоциированных с ядерным матриксом, которые получили название транскриптосом. По крайней мере, один из белковых компонентов, входящих в состав холофермента POL II животных, YY1, оказался идентичным фактору NMP-1, ассоциированному с ядерным матриксом. Возможно, именно с участием этого белка происходит прикрепление транскриптосом к ядерным мембранам.

Подводя итог рассмотрению основных этапов транскрипции, необходимо отметить, что инициация синтеза РНК, элонгация транскриптов и терминация транскрипции являются очень сложно организованными процессами. Структуры матричной ДНК и растущих цепей РНК оказывают влияние на процесс освобождения промотора РНК-полимеразами, а также на свойства самих элонгирующих и терминирующих ферментов. При этом на инициацию, задержку и прекращение транскрипции, расщепление РНК и ее реитеративный синтез, а

124

также на саму терминацию оказывают действие многочисленные белковые факторы. Все это находит свое выражение в сложности регуляторных процессов, обеспечивающих координированную экспрессию генов на уровне транскрипции. Основные биохимические механизмы, контролирующие эти процессы, будут рассмотрены в соответствующих разделах книги.

2.2. Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации РНК

Транскрипция у любого организма является первым этапом реализации генетической информации – экспрессии генов. Однако первичные транскрипты, как правило, представляют собой лишь предшественники зрелых мРНК – премРНК, которые перед выполнением своих функций должны претерпеть многочисленные изменения, называемые посттранскрипционными модификациями. Кроме того, у эукариот зрелые мРНК должны быть доставлены от места их биосинтеза (ядра) к месту трансляции (цитоплазматическим рибосомам), т.е. экспортироваться из ядра в цитоплазму.

Одной из наиболее удивительных посттранскрипционных модификаций пре-мРНК является редактирование их первичной структуры. В результате посттранскрипционно изменяется смысл генетической информации, заключенной в соответствующем гене.

Посттранскрипционные модификации РНК особенно характерны для эукариотических организмов, у которых в силу мозаичной интрон-экзонной структуры их генов первичные транскрипты представлены гигантскими предшественниками, включающими в себя последовательности как экзонов, так и интронов. 5’-Конец предшественника мРНК чаще всего подвергается котранскрипционным модификациям, в результате которых к его 5’-концевому нуклеотиду особым образом присоединяется остаток гуанозина с образованием "шапочки" – кэпа. Эта котранскрипционная модификация создает условия для прохождения следующего этапа процессинга мРНК – сплайсинга, сопровождающегося вырезанием последовательностей интронов и объединением экзонов с образованием непрерывной кодирующей последовательности мРНК. Одновременно от 3’-конца путем эндонуклеазного расщепления отделяется избыточный фрагмент РНК, и к оставшейся части присоединяется поли(А)-последовательность. Эта совокупность реакций получила название полиаденилирования мРНК. После таких

125

котранскрипционных и посттранскрипционных модификаций пре-мРНК образовавшаяся зрелая, стабилизированная мРНК переносится из ядра в цитоплазму, часто к специфическому месту своей внутриклеточной локализации, где может быть депонирована или эффективно транслироваться рибосомами. Каждый из этапов посттранскрипционных модификаций может использоваться для регуляции уровня экспрессии соответствующих генов.

2.2.1. Процессинг РНК у бактерий

мРНК прокариот обычно являются полицистронными, т.е. включают в себя последовательности нуклеотидов нескольких генов одного оперона (рис. I.10,а). Полицистронные мРНК бактерий при выполнении своих функций матричных РНК в трансляции не требуют разбиения на последовательности отдельных генов и могут транслироваться непосредственно рибосомами с образованием функционально активных белков. Исключением из правила являются полицистронные ранние мРНК нечетных T-бактериофагов Т3 и Т7, которые после транскрипции in vivo расщепляются до моноцистронных под действием РНКазы III, специфически гидролизующей двухцепочечные РНК. Участие этого фермента в процессинге указывает на наличие характерной вторичной структуры РНК на границах транскриптов отдельных генов вышеупомянутых бактериофагов, что и было обнаружено после определения их первичной структуры.

РНКаза III участвует также в процессинге предшественников рРНК у E. coli, поскольку 5S, 16S и 23S рРНК исходно синтезируются в составе общего

расположены тРНК. Кроме того, у бактерий обнаружены транскрипты генов тРНК, содержащие до шести тРНК в составе одного предшественника. В процессинге предшественников тРНК у бактерий ключевую роль играет РНКаза P. Для проявления нуклеазной активности у этого необычного фермента требуется присутствие небольшой РНК, прочно ассоциированной с его полипептидной цепью. Именно ей присуща собственная эндонуклеазная активность, что характерно и для других рибозимов (подробнее см. главу 9). Таким образом, зрелые молекулы рРНК и тРНК образуются в клетках как прокариот, так и эукариот в результате серии эндо- и экзонуклеазных

126

воздействий на их предшественники. Основной же посттранскрипционной модификацией является полиаденилирование их 3’-концевых последовательностей.

Полиаденилирование РНК у бактерий. Хотя поли(А)-полимераза E. coli,

осуществляющая безматричный синтез поли(А) при наличии РНК-затравок, была очищена в 1962 г., поли(А)-РНК у бактерий не была обнаружена до 1975 г.

Рис. I.10. Локализация сайтов полиаденилирования и пути катаболизма бактериальных РНК

а – обобщенная структура бактериальной полицистронной мРНК и положение сайтов полиаденилирования в РНК классов I-VI; б – альтернативные пути катаболизма бактериальных мРНК с участием поли(А)-полимеразы, полинуклеотидфосфорилазы (ПНФазы) и различных РНКаз; РНКаза Х – гипотетическая рибонуклеаза

и долгое время после этого рассматривалась как исключение из общего

127

правила и биологический курьез. В настоящее время стало ясно, что полиаденилирование РНК у бактерий столь же обычно, как и у эукариот, и выполняет важные биологические функции. Поли(А)-последовательности бактериальных мРНК значительно короче соответствующих эукариотических. Их длина, в среднем, составляет всего 14–16 нуклеотидов (80–200 – у эукариот), а полиаденилированы лишь от 1 до 40% молекул мРНК каждого определенного вида в клетке ( 100% в случае эукариот). Более подробное сравнение свойств поли(А)-последовательностей прокариот и эукариот проведено в разделе 2.2.3.

Классы поли(А)-содержащих РНК бактерий. В зависимости от расположения сайта присоединения поли(А)-последовательности все бактериальные РНК разделяют на шесть классов (см. рис. I.10,а). В РНК первого класса происходит полиаденилирование 3’-концевого нуклеотида, следующего сразу за терминаторной шпилькой ρ-независимого терминатора последней кодирующей области. У РНК второго класса терминаторная шпилька отщепляется посттранскрипционно РНКазой Е, и к образующемуся 3’-концу присоединяется поли(А). Терминаторная шпилька отсутствует и у полиаденилированных мРНК третьего класса, образующихся с участием ρ- зависимых терминаторов транскрипции, благодаря особенностям структуры таких терминаторов. В укороченных мРНК четвертого класса отсутствует 3’- концевая кодирующая область, а поли(А) начинается непосредственно за межцистронной терминаторной шпилькой. В РНК пятого класса поли(А)- последовательности локализуются на концах укороченных цистронов, а у РНК шестого класса – на концах 5’-концевых некодирующих последовательностей. На основании структуры поли(А)+-мРНК делается вывод, что полиаденилирование у бактерий не зависит от присутствия в РНК специфических регуляторных сигналов, как это имеет место у эукариот, а определяется наличием у них свободных 3’-OH-групп. Такие промежуточные мРНК разной длины, по-видимому, появляются в результате деградации или преждевременной терминации синтеза полноразмерных транскриптов.

Поли(А)-полимеразы. Полиаденилирование бактериальных мРНК катализирует поли(А)-полимераза (ATP:полирибонуклеотидаденилилтрансфераза), которая осуществляет независимое от матрицы

128

последовательное присоединение остатков аденилата к 3’-OH-концам молекул РНК в соответствии со следующей реакцией:

РНК + nATP → РНК(А)n + nPPi

У E. coli описаны две поли(А)-полимеразы. Поли(А)-полимераза I кодируется локусом pcnB, первоначально идентифицированным в качестве контролирующего число копий плазмид в бактериальных клетках. Процессированная молекула представляет собой полипептид с молекулярной массой 52 кДа, не обладающий гомологией с соответствующими эукариотическими ферментами, однако содержащий сегмент, гомологичный части полипептидной цепи тРНК-нуклеотидилтрансферазы, которая осуществляет посттранскрипционное присоединение акцепторного CCAтринуклеотида к молекулам тРНК. Даже умеренная сверхэкспрессия рекомбинантного гена pcnB летальна для E. coli. Полная инактивация гена pcnB с помощью делеций не сопровождается прекращением полиаденилирования мРНК, что указывает на присутствие в геноме E. coli второго аналогичного гена. Такой ген был обнаружен в виде открытой рамки считывания f310, кодирующей полипептид с молекулярной массой 36,3 кДа, обогащенный гидрофобными аминокислотами. Полипептид не обладает гомологией ни с одной из известных бактериальных, вирусных или эукариотических поли(А)-полимераз.

Возможная функциональная роль полиаденилирования РНК у бактерий. Несмотря на то что полиаденилирование РНК интенсивно исследуется более 25 лет, его функциональная роль даже у эукариот полностью не выяснена. Еще меньше известно о роли полиаденилирования РНК у бактерий. Однако из имеющихся данных становится ясно, что влияние полиаденилирования РНК на молекулярные процессы бактериальной клетки весьма разнообразно и распространяется, по крайней мере, на контроль числа копий бактериальных плазмид, стабильность мРНК и ее трансляцию.

Регуляция репликации плазмид через полиаденилирование антисмысловых РНК. Более подробно механизмы регуляции репликации бактериальных плазмид будут рассмотрены в разделе 4.2.2 на примере плазмиды ColE1. Здесь же лишь кратко отметим, что у некоторых групп плазмид, например ColE1 или pBR322, которая является ее производной, регуляция числа копий осуществляется с помощью антисмысловой РНК (РНК I),

129

образующей гибрид с РНК-праймером (РНК II), необходимым для инициации их репликации, и блокирует его функционирование. В соответствии с этим внутриклеточная концентрация РНК I является критическим параметром в регуляции репликации плазмид. Деградация РНК I инициируется отщеплением 5’-концевого пентануклеотида под действием РНКазы Е (РНК I–5) и далее контролируется поли(А)-полимеразой – продуктом гена pcnB. Полиаденилированная РНК I–5 обладает коротким временем полужизни, типичным для бактериальных мРНК (1–2 мин), тогда как немодифицированная РНК I–5 значительно более стабильна (время полужизни – >10 мин). Ускоренная деградация поли(А)-РНК I–5 инициируется полинуклеотидфосфорилазой. У поли(А)--РНК I–5 3’-концевой нуклеотид находится в составе шпильки, что препятствует эффективному действию полинуклеотидфосфорилазы. Однако при наличии короткого поли(А)-хвоста, выступающего за пределы шпильки, РНК I–5 эффективно расщепляется ферментом по 3’-экзонуклеазному механизму. В разрушение поли(А)+-РНК I–5 вносят свой вклад и другие нуклеазы, включая РНКазу Е и РНКазу III. Имеются данные и том, что полиаденилирование само по себе инактивирует РНК I–5, так как оно приводит к характерному изменению ее вторичной структуры.

Влияние полиаденилирования на время полужизни бактериальных мРНК. Описанное выше дестабилизирующее действие полиаденилирования на антисмысловые РНК распространяется и на некоторые бактериальные мРНК. Например, инактивация гена pcnB, кодирующего поли(А)-полимеразу, с помощью делеций сопровождается значительным увеличением времени полужизни мРНК генов lpp, trxA, ompA, а также rpsO на фоне мутаций pnp, rnb и rne, инактивирующих гены полинуклеотидфосфорилазы и соответствующих рибонуклеаз. Поскольку эти результаты были получены в отсутствие РНКазы Е, 3’-концы большинства бактериальных мРНК содержали шпильку, характерную для ρ-независимых терминаторов транскрипции (см. рис. I.10). Экзонуклеазное расщепление РНК под действием полинуклеотидфосфорилазы и РНКазы II затруднено при наличии такой шпильки и облегчается в присутствии выступающей поли(А)-последовательности (см. рис. I.10,б). Как показано на рисунке, первичный транскрипт в бактериальных клетках может или полиаденилироваться, или подвергнуться экзонуклеазному расщеплению, неэффективному без поли(А)-последовательности, при наличии которой в

130

процесс деградации активно включаются полинуклеотидфосфорилаза и РНКаза II. РНКаза Е может отщеплять как полиаденилированную, так и неполиаденилированную шпильку. Такой незащищенный с 3’-конца транскрипт подвергается атаке 3’-экзонуклеаз, с которой конкурирует полиаденилирование, препятствующее деградации мРНК по этому механизму. Следовательно, полиаденилирование мРНК в бактериальных клетках может выполнять альтернативные функции: дестабилизировать транскрипты при наличии у них 3’-концевых шпилек и стабилизировать "линейные" формы мРНК. Предполагается участие в деградации поли(А)+-мРНК и неизвестной РНКазы Х, поскольку этот процесс может происходить на фоне неактивных полинуклеотидфосфорилазы, РНКазы II и РНКазы Е.

Изображенная на рис. I.10 схема катаболизма первичных бактериальных транскриптов является упрощением, так как предполагает независимое действие нуклеаз. В последнее время, в соответствии с общей тенденцией, накапливаются данные о координированной работе большинства компонентов системы деградации бактериальных РНК в составе сложных мультиферментных комплексов, получивших название деградосом. Полное расщепление РНК с 3’-концевой шпилькой деградосомами требует расхода ATP ATP-зависимой РНК-хеликазой, а также участия белка DnaK, белков теплового шока, энолазы и гликолитического фермента с неизвестной функцией в метаболизме РНК.

Возможная роль полиаденилирования бактериальных мРНК в трансляции. Как будет видно из дальнейшего изложения (см. раздел 2.2.3), поли(А)-последовательности эукариотических РНК постоянно ассоциированы с жизненно важным поли(А)-связывающим белком PAB, который участвует как в регуляции стабильности мРНК, так и их трансляции. Поиск белка с аналогичными функциями у бактерий привел к очистке рибосомного белка S1, который кооперативно связывается с поли(А)-последовательностями мРНК с константой ассоциации 3·106 М–1. Функциональная роль этого взаимодействия в настоящее время не ясна, однако предполагают, что оно может оказывать влияние на трансляцию. Возможно, белок S1 облегчает доставку мРНК к 30S субчастицам рибосом, что должно стимулировать инициацию трансляции.

Полиаденилирование мРНК в митохондриях и хлоропластах.

Концепция эндосимбиотического происхождения митохондрий и хлоропластов