Экспрессия генов Патрушев

101

Современные модели структуры элонгирующих тройных комплексов и механизма элонгации растущих цепей РНК. В 1992 г.

М. Чамберлин с сотрудниками разработали модель элонгации РНК, которая содержала целый ряд новых идей. Прежде всего было постулировано, что процессы транслокации РНК-полимеразы вдоль ДНК и присоединение нуклеотидов к растущей цепи РНК в активном центре фермента разделены во времени. Это разделение становится возможным благодаря наличию в молекуле РНК-полимераз двух ДНК-связывающих сайтов, каждый из которых перекрывает на матричной ДНК 10 нуклеотидных пар (см. рис. I.8). Сайт I локализован в задней по отношению к направлению транскрипции части фермента, а сайт II – в передней. Предполагалось также, что эти два сайта могут перемещаться вдоль ДНК в процессе элонгации независимо друг от друга. В соответствии с предложенной моделью, молекула РНК-полимеразы перемещается вдоль ДНК наподобие гусеницы: когда один из сайтов связывания ДНК фиксирован, другой может двигаться вперед. Еще одной новой чертой модели было предположение о том, что растущая цепь РНК удерживается внутри элонгирующего комплекса не 12-нуклеотидным ДНК–РНК- гибридом, а двумя сайтами связывания самой РНК-полимеразы, каждый из которых перекрывает 10 нуклеотидов матрицы. При этом длина участка РНК, заключенного между сайтами связывания, составляет 30–40 нуклеотидов. Предполагалось также, что перемещение каталитического центра молекулы РНК-полимеразы сопряжено с движением переднего сайта связывания ДНК II и может происходить независимо от переноса заднего сайта I вперед вдоль РНКсвязывающего сайта I во время добавления нуклеотидов к растущей цепи РНК, сопровождаемого заполнением этого сайта (см. рис. I.8,б,1).

Согласно предложенной модели элонгация цепей РНК представляется в виде циклического процесса. В начале цикла каталитический центр молекулы РНК-полимеразы располагается у задней границы РНК-связывающего сайта I в соответствии с положением 3’-ОН-конца РНК. Последовательно присоединяя нуклеотиды к растущей цепи РНК, каталитический участок перемещается относительно РНК-связывающего сайта I и в конце концов заполняет этот сайт десятью нуклеотидами вновь синтезированного участка РНК (см. рис. I.8,б,1). Во время этой фазы элонгации ДНК-связывающий сайт I остается фиксированным на ДНК, тогда как ДНК-связывающий сайт II перемещается

102

вперед синхронно с каталитическим участком на десять нуклеотидов. В конце фазы добавления нуклеотидов ДНК- и РНК-связывающие сайты II фиксируются на своих лигандах, а ДНК-связывающий сайт I переносится вперед на десять нуклеотидов в новое фиксированное положение. Это перемещение освобождает РНК-связывающий сайт I, делая его готовым к повторению цикла транслокации.

Волна исследований, последовавшая за появлением этих новых идей, быстро подтвердила реальность основных положений модели элонгации транскриптов, выдвинутых группой М. Чамберлина, и дополнила ее рядом существенных моментов. Оказалось, что перемещение тройного комплекса вдоль транскрибируемой ДНК не всегда скачкообразно. Большую часть транскрибируемых ДНК молекулы РНК-полимеразы проходят монотонно, регулярно присоединяя к растущим цепям РНК нуклеотид за нуклеотидом. Прерывистая, скачкообразная элонгация РНК имеет место лишь на участках матричной ДНК, в которых происходит задержка транскрипции или ее полное прекращение. Встретив препятствие на своем пути в виде специфической последовательности нуклеотидов или белков, ассоциированных с ДНК, молекула РНК-полимеразы в составе тройного комплекса переходит во внутренне напряженное состояние, которое она может разрешить тремя путями: или преодолеть препятствие, переместив свою переднюю границу вперед за пределы препятствия, и продолжить монотонную элонгацию транскрипта, или терминировать транскрипцию (см. рис. I.8,б,2), или полностью прекратить синтез РНК. В последнем случае каталитический участок фермента смещается назад по отношению к синтезированной РНК и ее 3’-концевой нуклеотид становится недоступным для элонгации (см. рис. I.8,б,3). Эндонуклеазное отщепление 3’-концевого фрагмента РНК в комплексе, прекратившем элонгацию, реактивирует транскрипцию. Очищенные РНКполимеразы, особенно РНК-полимераза II эукариот, из-за частых задержек на матрице в процессе элонгации транскрибируют молекулы ДНК со скоростью, по крайней мере, в 10 раз меньшей, чем in vivo. В этом случае стимулирующее действие на элонгацию оказывают специфические факторы элонгации.

Основные факторы элонгации РНК-полимеразы II. У эукариот имеются белковые факторы элонгации РНК, которые относят к двум различным

103

классам: основным (general) и регуляторным факторам. Как и в случае основных факторов инициации транскрипции, основные факторы элонгации РНК обеспечивают эффективную транскрипцию всех генов, кодирующих белки, тогда как регуляторные факторы специфически контролируют экспрессию отдельных генов или даже целых их семейств. Основные факторы элонгации РНК-полимеразы II и некоторые их свойства перечислены в табл. I.5. Первыми в этой таблице упомянуты белки P-TEFb (positive transcript elongation factor b) и SII, которые препятствуют переходу задержанных элонгирующих комплексов РНК-полимеразы II в состояние полного прекращения транскрипции. Активность фактора P-TEFb, впервые

Примечание. DRB – 5,6-дихлоро-1-β-D-рибофуранозилбензимидазол

104

выделенного в гомогенном состоянии из экстрактов Drosophila, подавляется нуклеотидным аналогом – DRB. Фенотипическим проявлением действия этого ингибитора является общее подавление синтеза гяРНК в ядрах вследствие резкого повышения частоты перехода элонгирующего комплекса в состояние полного прекращения транскрипции вблизи промоторов. DRB не подавляет элонгацию цепей РНК в бесклеточных системах транскрипции, реконструированных из высокоочищенных компонентов, что дало основание предполагать наличие дополнительных факторов, которые контролируют процесс перехода комплексов РНК-полимеразы II в фазу элонгации и чувствительны к действию этого ингибитора. Фактор P-TEFb оказался белком, обладающим именно такими свойствами. Механизм действия P-TEFb, благодаря которому этот фактор препятствует прекращению транскрипции РНК-полимеразой II, неизвестен. Предполагают, что он может быть связан с фосфорилированием РНК-полимеразы II или сопутствующих факторов транскрипции.

Небольшой белковый фактор SII, впервые выделенный из клеток асцитной опухоли Эрлиха, обеспечивает преодоление РНК-полимеразой II препятствий в виде нуклеопротеиновых комплексов или специфических последовательностей ДНК, вызывающих преждевременное прекращение транскрипции в кодирующих частях генов. Однако он не оказывает влияния на РНК-полимеразу, прекратившую элонгацию в DRB-чувствительной фазе. Фактор SII стимулирует эндонуклеазное отщепление 3’-концевой части транскрипта в комплексе, прекратившем элонгацию, что дает возможность РНКполимеразе II продолжить элонгацию цепи РНК. Активный сайт РНКполимеразы, обладающий такой эндонуклеазной активностью, ингибируется α- аманитином – специфическим ингибитором РНК-полимеразы II эукариот. Клетки дрожжей, у которых фактор SII инактивирован под действием мутаций, обладают повышенной чувствительностью к 6-азаурацилу и микофеноловой кислоте, которые, как известно, ингибируют биосинтез нуклеотидов, понижая внутриклеточное содержание GTP и UTP. Это, в свою очередь, оказывает сильное влияние на эффективность элонгации РНК РНК-полимеразой II в мутантных клетках.

Другая группа основных факторов элонгации супрессирует задержку элонгации цепей РНК, тем самым уменьшая вероятность перехода

105

элонгирующих комплексов в состояние полного прекращения элонгации. Эту группу составляют три структурно неродственных белка: факторы TFIIF, элонгин (SIII) и ELL, которые, по-видимому, взаимодействуют непосредственно с компонентами тройного элонгирующего комплекса. Ни один из этих белков не способен реактивировать комплексы, полностью прекратившие транскрипцию, или стимулировать расщепление РНК в этих комплексах. Точный механизм супрессирующего действия данных факторов на задержку элонгации неизвестен. Недавно было установлено, что и элонгин, и фактор TFIIF резко повышают способность РНК-полимеразы II осуществлять зависимое от матрицы присоединение рибонуклеозидтрифосфатов к 3’-OH-концам фрагментов ДНК, которые в этом случае выполняют функцию праймеров. Предполагают, что роль элонгина и фактора TFIIF может заключаться в обеспечении правильного расположения в активном центре элонгирующего фермента 3’-OH-концов растущих транскриптов. Фактор TFIIF занимает особое место среди других основных факторов транскрипции, поскольку только он обладает способностью контролировать активность РНК-полимеразы II как на стадии инициации транскрипции, так и в фазе элонгации. При этом способность этого фактора оказывать действие на инициацию транскрипции или элонгацию контролируется разными доменами его полипептидных цепей.

Элонгин (SIII) впервые был выделен из ядер печени крыс в виде белкового комплекса, состоящего из трех субъединиц A, B и C с молекулярными массами ~150, 18 и 15 кДа соответственно. Транскрипционная активность элонгина (SIII) целиком ассоциирована с его A-субъединицей, а две другие служат регуляторными и после образования стабильного димера оказывают сильное стимулирующее действие на транскрипционную активность A-субъединицы. Собственно стимулятором активности элонгина А является элонгин C, тогда как элонгин B, гомологичный убиквитину, не взаимодействует стабильно с элонгином А в отсутствие элонгина С и выполняет шапероноподобную функцию при сборке всего комплекса элонгина (SIII). На особую роль элонгина (SIII) в регуляции экспрессии генов указывает тот факт, что у человека он известен как потенциальная мишень действия продукта антионкогена (гена-супрессора опухолей) von Hippel–Lindau (VHL), мутации в котором ассоциированы с возникновением многих видов рака у человека. Белок VHL специфически взаимодействует с комплексом элонгина BC, препятствуя

106

его связыванию с элонгином А. При этом мутации в антионкогене, сопровождающие онкологические заболевания, уменьшают прочность взаимодействия мутантного белка с элонгином BC.

Ген фактора элонгации ELL (eleven–nineteen lysine-rich leukemia)

человека, локализованный на хромосоме 19 (19p13.1), первоначально был обнаружен в связи с его частыми транслокациями в ген MLL (mixed lineage leukemia) на хромосому 11 (11q23) при острых миелоидных лейкозах. Предполагают, что продукт гена MLL участвует в регуляции транскрипции гомеозисных генов. В результате транслокации образуется "онкоген", кодирующий гибридный белок, который образован почти полным полипептидом ELL, объединенным с N-концевой частью белка MLL. Роль белка ELL в развитии лейкозов неясна, поскольку в настоящее время обнаружены шесть других генов, претерпевающих транслокацию в то же самое место на хромосоме 11, которые ассоциированы с лейкозами с различными клиническими проявлениями, характер которых зависит от природы транслоцируемого гена.

Терминация транскрипции. Прекращение синтеза РНК под действием РНК-полимеразы и освобождение РНК из транскрипционного комплекса происходят в конце транскрипционных единиц на особых участках ДНК - терминаторах транскрипции. Терминаторы транскрипции, функционирующие с разной эффективностью, могут находиться и внутри транскриптонов. Такие терминаторы являются мощными факторами, регулирующими уровень транскрипции (и других этапов экспрессии) соответствующих генов. Для осуществления терминации транскрипции на некоторых терминаторах РНКполимеразам не требуется дополнительных белковых факторов, тогда как другие терминаторы в их отсутствие не функционируют.

Терминация транскрипции у бактерий. Типичные терминаторы, не требующие для своего распознавания РНК-полимеразой E. coli дополнительных белковых факторов, содержат GC-богатый участок, обладающий центральной симметрией, вслед за которым располагается последовательность нуклеотидов, состоящая из выстроенных подряд четырех– восьми остатков A, в матричной цепи ДНК. Транскрипция завершается на конце этой олиго(A)-последовательности или же на следующем за ней нуклеотиде. Предполагается, что после прохождения РНК-полимеразой GC-богатого

107

участка ДНК с центральной симметрией в этом месте РНК образуется шпилька, что приводит к разрушению ДНК–РНК-гибрида в транскрибирующем комплексе.

Рис. I.9. Аттенюатор триптофанового оперона E. coli и его функционирование

Изображены альтернативные вторичные структуры мРНК в районе аттенюатора, образование которых сопровождается прекращением транскрипции или распространением в область структурных генов оперона

Оставшаяся часть ДНК–РНК-гибрида нестабильна и легко плавится, поскольку образована 3’-концевой олиго(U)-последовательностью РНК и олиго(dA)-последовательностью терминатора. Первым из комплекса освобождается РНК-продукт, а затем минимальный фермент РНК-полимеразы.

108

После объединения со свободным σ-фактором образовавшийся холофермент РНК-полимеразы вступает в новый цикл транскрипции. Эффективность терминации транскрипции на таком терминаторе зависит от стабильности терминаторной шпильки РНК: мутации, нарушающие комплементарное спаривание оснований в шпильке, ослабляют терминацию, а мутации, восстанавливающие комплементарность, ее усиливают.

Кроме вышеописанного, у E. coli обнаружены терминаторы транскрипции, распознаваемые РНК-полимеразой только в присутствии белкового фактора терминации ρ, механизм действия которого хорошо изучен. Этот белок с молекулярной массой 46 кДа обладает РНК-зависимой нуклеозидтрифосфатазной активностью, которая необходима для его функционирования при терминации. Кроме того, для него характерна РНК:ДНКхеликазная активность. Установлено, что фактор ρ связывается с растущей цепью РНК в особых неструктурированных участках, называемых рат-сайтами (rut sites, от англ. rut – колея, выбоина), до того, как РНК-полимераза достигает терминатора. В местах ρ-зависимой терминации транскрипции РНК-полимераза прекращает элонгацию. Считается, что роль ρ-фактора заключается в вытеснении РНК из транскрипционного комплекса во время таких пауз.

E. coli и другие бактерии имеют еще один тип регулируемых терминаторов транскрипции, называемых аттенюаторами. Впервые обнаружен и лучше других изучен аттенюатор триптофанового оперона, контролирующего биосинтез Trp в бактериальных клетках (см. рис. I.9). В условиях избытка внутриклеточного Trp девять из десяти молекул РНКполимеразы, начавших транскрипцию триптофанового оперона, прекращают синтез РНК на аттенюаторе, расположенном на расстоянии в 180 п.о. от точки инициации транскрипции. В результате в основном происходит синтез коротких РНК той же длины, называемых лидерными. При уменьшении содержания Trp в клетках доля молекул РНК-полимеразы, преодолевающих аттенюатор, возрастает, что, в конечном счете, сопровождается увеличением внутриклеточного содержания ферментов биосинтеза Trp. Перед аттенюатором находятся несколько участков ДНК, последовательности которых обладают центральной симметрией. Это приводит к тому, что лидерная РНК, включающая в себя последовательности, комплементарные таким участкам, способна

109

образовывать структуры типа шпилек в разных сочетаниях, которые исключают друг друга. Например, если получена шпилька 2/3, то шпильки 1/2 и 3/4 сформироваться уже не могут. К аналогичным результатам приводит и обратное развитие событий. Шпилька 3/4 является терминаторной, присутствующей в ρ-независимых терминаторах. За ней в лидерной РНК располагается последовательность олиго(U). Поэтому образование шпильки 3/4 сопровождается терминацией транскрипции на аттенюаторе и освобождением лидерной РНК из транскрипционного комплекса. Формирование альтернативных шпилек зависит от положения рибосом, транслирующих лидерную РНК с образованием лидерного пептида, в котором присутствуют два остатка Trp подряд. В условиях недостатка Trp рибосома в процессе синтеза лидерного пептида останавливается на соответствующих кодонах лидерной РНК, прикрывая собой последовательность 1, что препятствует формированию шпильки 1/2, так как образуется шпилька 2/3. В соответствии с этим терминаторная шпилька не может сформироваться, транскрипция не прерывается на аттенюаторе и РНК-полимераза переходит в область структурных генов оперона. Если недостаток триптофана не приводит к прекращению трансляции лидерной РНК, рибосома проходит критический участок лидерной РНК, препятствуя формированию шпильки 2/3, и образуется терминаторная шпилька 3/4, что сопровождается терминацией транскрипции на аттенюаторе.

Терминация транскрипции у эукариот. У эукариот обнаружены три фактора терминации транскрипции, необходимых для освобождения РНКполимераз из транскрипционных комплексов на терминаторах – по одному для РНК-полимераз I, II и III. Белок N-TEF дрозофилы индуцирует освобождение транскриптов, синтезированных РНК-полимеразой II, и при его функционировании происходит расщепление ATP. У дрожжей белковый фактор Reb-1 связывается с природными терминаторами транскрипции на ДНК, обеспечивая как остановку элонгирующей РНК-полимеразы I на этих терминаторах, так и последующее освобождение РНК из транскрипционных комплексов. Удаление в результате делеции из рибосомной транскрипционной единицы Reb-1-связывающего сайта нарушает правильное образование 3’- концов рРНК in vivo. Мышиный фактор TTF-1, который также является ДНКсвязывающим белком, необходим для правильной терминации транскрипции

110

РНК-полимеразой I в клетках этих животных. У них же обнаружен LА-белок, специфически взаимодействующий с РНК, функционирование которого требуется для образования транскриптов полной длины под действием РНКполимеразы III, что происходит в результате освобождения РНК из транскрипционных комплексов и реинициации транскрипции.

Рассмотрим подробнее механизм терминации транскрипции Pol I. У мышей терминация транскрипции рДНК происходит на 565 п.о. ниже кодирующей части гена 28S РНК. 3'-Конец терминирующего транскрипта картирован за 21 п.о. перед 18-нуклеотидным повтором, названным Sal-боксом (AGGTCGACCAGA/TT/ANTCCG), который входит в состав терминатора транскрипции. Десять таких повторов, фланкированных протяженными кластерами пиримидиновых оснований, локализованы в нетранскрибируемых спейсерах рДНК. У человека длина повтора составляет 11 п.о. (GGGTCGACCAG), и его последовательность соответствует таковой 5'- концевой части мышиного повтора. Последовательности, фланкирующие повторы, оказывают влияние на точность и эффективность терминации транскрипции, а функционирование всего терминатора зависит от его ориентации на ДНК.

С помощью мутационного анализа и футпринтинга было установлено, что фактор терминации транскрипции TTF-I взаимодействует с Sal-боксом и останавливает элонгирующую Pol I. Хотя все факторы терминации транскрипции, обсуждавшиеся выше, распознают разные последовательности нуклеотидов, для них характерно наличие в C-концевых частях двух ДНКсвязывающих доменов длиной в 80 аминокислот каждый, гомологичных ДНКсвязывающей последовательности онкобелка c-Myb. Хотя более половины полипептидной цепи с N-конца TTF-I могут быть удалены без потери его функций, одних лишь ДНК-связывающих доменов недостаточно для обеспечения белком терминации транскрипции, и для этого требуются прилегающие последовательности аминокислот. Факторы терминации транскрипции TTF-I мышей и Rib-1 дрожжей могут прекращать элонгацию цепей РНК на любой из этих ДНК. Это указывает на высокую эволюционную консервативность механизма терминации транскрипции Pol I.

Связываясь с последовательностями терминаторов, TTF-I изгибает молекулу ДНК и вызывает задержку элонгирующего транскрипционного