Экспрессия генов Патрушев

71

Среди факторов, которые отличаются от основных факторов транскрипции, но играют особую роль в транскрипции у дрожжей, следует отметить так называемые SRB-белки (suppressor of RNA polymerase B).

Последние являются неотъемлемой частью холофермента Pol II и относятся к коактиваторам транскрипции. SRB-Белки идентифицированы с помощью генетических методов при отборе мутаций у дрожжей, которые супрессировали условно-летальные мутации в CTD-домене Pol II (С-концевом домене большой субъединицы РНК-полимеразы II). Такой генетический скрининг привел к открытию девяти генов SRB. С помощью тех же мутантов установлено, что SRB-белки необходимы для осуществления инициации транскрипции РНКполимеразой in vivo. Вскоре было подтверждено физическое и функциональное взаимодействие между SRB-белками и CTD-доменом Pol II, которые, как оказалось, образуют с РНК-полимеразой прочный комплекс.

Транскрипция с участием холофермента Pol II стимулируется активатором GAL4–VP16, что не происходит в присутствии только одних очищенных основных факторов транскрипции и Pol II. На этом основании был сделан вывод, что истинный холофермент Pol II содержит дополнительные компоненты, которые позволяют ему реагировать на действие белковактиваторов транскрипции. Более того, показано, что антитела к CTD-домену вызывают диссоциацию многосубъединичного комплекса, содержащего Pol II, SRB-белки, TFIIF, GAL11/SPT13, SUG1 и еще 10 белков, часть из которых относится к классу белков-коактиваторов транскрипции. Этот комплекс белков получил название медиаторного комплекса. Он оказался необходимым для осуществления функциональной связи между Pol II и белками-активаторами транскрипции (подробнее о коактиваторах транскрипции см. раздел 3.2.2).

Субъединичное строение РНК-полимераз разного происхождения, вероятно, отражает их функциональную роль в акте транскрипции. Действительно, все РНК-полимеразы простого строения транскрибируют узкоограниченный круг генов или небольшие части генома, что имеет место, например при синтезе РНК-затравок для фрагментов Оказаки в процессе репликации ДНК у бактерий. Промоторы, узнаваемые РНК-полимеразами простого строения, не отличаются разнообразием и обладают простой структурой. Показательно, что при сложном строении генома четных T-фагов, в процессе развития которых происходит многократное переключение

72

транскрипции с одних групп генов на другие, используется сложная РНКполимераза бактерии-хозяина, а не индуцируется простой фермент, как это имеет место у бактериофага T7.

РНК-полимеразы бактерий и эукариот должны, во-первых, узнавать разные промоторы, во-вторых, реагировать на различные белки-регуляторы и, в-третьих, изменять специфичность узнавания последовательностей нуклеотидов матричных ДНК под действием разнообразных белковых эффекторов. Отсюда следует, что у живых организмов, начиная с бактерий, возникает потребность в РНК-полимеразах сложной структуры, способных осуществлять обширную программу реализации генетической информации. Вероятно, поэтому наблюдается иерархия в степени сложности строения указанных ферментов, которая достигает верхнего предела в случае РНКполимераз эукариот.

Тем не менее, элементарные акты основных этапов транскрипции (см. ниже) обеспечиваются молекулами РНК-полимераз простого строения, такими как у фагов T7, митохондрий и других объектов. Эти ферменты, по мнению Р.Б. Хесина, можно рассматривать в качестве эволюционных предшественников сложных олигомерных РНК-полимераз, способных самостоятельно осуществлять все основные функции в процессе транскрипции. Действительно, у олигомерных РНК-полимераз, как и у большинства сложноустроенных ферментов, по-видимому, только одна субъединица (β – у РНК полимераз эубактерий) является собственно каталитической, а остальные, возможно, выполняют функции регуляторных.

2.1.2. Единицы транскрипции (транскриптоны)

Синтез РНК молекулами РНК-полимераз in vivo начинается в определенных местах ДНК, называемых промоторами, и завершается на особых регуляторных последовательностях – терминаторах. Последовательности нуклеотидов ДНК, заключенные между промоторами и терминаторами, называют транскрипционными единицами, или

транскриптонами. В пределах каждого транскриптона транскрибируется только одна цепь ДНК, которая получила название значащей или матричной. Термины "транскрипционная единица" или "транскриптон" по смыслу близки

73

термину "ген", но они не всегда совпадают. Так, транскрипционные единицы прокариот, как правило, заключают в себе генетическую информацию нескольких генов и называются оперонами. Продуктами транскрипции оперонов являются полицистронные мРНК, в результате трансляции которых рибосомами образуется несколько белков. Белки, кодируемые полицистронными мРНК, обычно функционально связаны друг с другом и обеспечивают протекание какого-либо метаболического процесса, например биосинтеза определенной аминокислоты или утилизацию углеводов в качестве источника углерода. Организация генов в виде оперонов облегчает координированную регуляцию их экспрессии на уровне транскрипции. Согласованная регуляция транскрипции (и других этапов экспрессии) многих генов, не образующих одного оперона, чаще всего осуществляется специфическими белками-регуляторами, которые взаимодействуют с гомологичными регуляторными нуклеотидными последовательностями, маркирующими гены данной группы.

Промоторы эубактерий. В 1964 г. Ф. Жакобом, А. Уллманом и Ж. Моно была впервые сформулирована концепция промотора как особого регуляторного элемента в составе lac-оперона E. coli. Вскоре после этого были описаны промоторные мутации и высказано предположение, что промоторные участки оперона должны распознаваться молекулами РНК-полимеразы, а также заключать в себе сайт инициации транскрипции. В соответствии с генетическими критериями промотором может называться последовательность нуклеотидов, мутации в которой характеризуются следующими свойствами: 1) оказывают влияние на транскрипцию всех генов оперона; 2) действуют в цис-, но не транс-положении по отношению к генам, контролируемым мутантными промоторами; 3) локализуются вблизи одного из концов оперона, однако отличаются от мутаций в структурных частях генов тем, что не оказывают влияния на активность кодируемых этими генами ферментов. В соответствии с биохимическими критериями промотор представляет собой последовательность нуклеотидов, обеспечивающую базальный (но не максимальный) уровень транскрипции соответствующего транскриптона. Он является той минимальной последовательностью, которая специфически распознается холоферментом РНК-полимеразы среди случайных последовательностей нуклеотидов, что обнаруживается по образованию в

74

определенных условиях стабильных комплексов фермент–ДНК.

Структура обобщенного минимального промотора для холофермента РНК-полимеразы (Eσ70) эубактерий схематически представлена на рис. I.4,б. Такие промоторы содержат две канонические последовательности: область -35, обычно расположенную между нуклеотидами в положениях –30 и –35, и область –10, локализованную между нуклеотидами –7 и –10 (знак "минус" указывает на то, что нуклеотиды находятся перед первым транскрибируемым нуклеотидом, которому соответствует положение +1). Обе эти последовательности специфически взаимодействуют с двумя участками полипептидной цепи σ70, называемыми σ4.2 и σ2.4. Расстояние между обсуждаемыми последовательностями оказывает влияние на активность промотора. Длина отрезка в 17 п.о. является оптимальной. Среди других последовательностей, оказывающих влияние на активность промоторов, но не являющихся универсальными, следует упомянуть так называемый UP-элемент

– АТ-богатую последовательность, центр которой находится в положении –52 у промотора P1 гена rrnB, кодирующего рРНК. С этим участком взаимодействует α-субъединица РНК-полимеразы. У нескольких других промоторов был обнаружен TG-элемент (центр – в положении –15 или –14), мутации в котором снижают активность этих промоторов.

Влияние мутаций в областях –10 и –35 на активность промотора, как правило, хорошо коррелирует с тем, насколько новая мутантная последовательность соответствует канонической. Однако в ряде случаев наблюдаются отклонения от этого правила, что позволило идентифицировать последовательности, важные для функционирования этих промоторов in vivo, с центрами в положениях –43 (область USR – upstream region), а также между нуклеотидами в положениях –1 и +20 (область DSR – downstream region). Эти последовательности не требуются для узнавания промотора РНК-полимеразой, однако облегчают процесс освобождения промотора после инициации транскрипции (см. ниже). Все описанные последовательности обеспечивают базальный уровень функционирования бактериальных промоторов. Однако активность промоторов может изменяться под действием многочисленных регуляторных факторов, взаимодействующих с другими регуляторными последовательностями, расположенными перед такими промоторами. Эти

75

аспекты регуляции активности промоторов будут подробно рассмотрены в разделе 3.1.

Промоторы эукариот. Промоторы эубактерий были определены выше как минимальный набор последовательностей нуклеотидов, необходимых для их специфического распознавания холоферментом РНК-полимеразы и начала (инициации) синтеза РНК. Распространение этого определения на промоторы эукариот встречает трудности из-за невозможности в настоящее время исчерпывающе описать эукариотический функциональный аналог бактериального холофермента Eσ.

Промоторы РНК-полимеразы II. Промоторы, узнаваемые РНК-

полимеразой II, содержат три различных семейства регуляторных последовательностей ДНК. Последовательности первого семейства включают так называемые кóровые, или базальные элементы промотора, расположенные вблизи точки инициации транскрипции (см. рис. I.4,б). В настоящее время известны два класса базальных элементов: TATA-последовательность, расположенная за 25–30 нуклеотидов до точки инициации (каноническая последовательность – TATAa/tAa/t), и так называемый инициатор (Inr), последовательность которого обогащена пиримидинами (каноническая последовательность – PyPyA+1NT/APyPy). В этих обозначениях строчные буквы соответствуют нуклеотидам, которые присутствуют не во всех последовательностях, Py – пиримидиновые нуклеотиды инициатора, N – любой нуклеотид. Подстрочная цифра указывает на то, что с данного нуклеотида начинается транскрипция (точка инициации транскрипции). Элементы TATAпоследовательности и инициатор необходимы для сборки ДНК-белкового инициационного комплекса и распознаются основными факторами транскрипции. Промоторы РНК-полимеразы II содержат один или оба регуляторных элемента или же не имеют их вообще. При этом оба элемента могут функционировать независимо друг от друга или же в их действии наблюдается синергизм.

К двум другим классам цис-регуляторных промоторных элементов у эукариот относятся последовательности, расположенные вблизи промотора (от 50 до нескольких сотен пар оснований перед точкой инициации), а также дистальные элементы (энхансеры и сайленсеры), расстояние которых от промотора может превышать 60 т.п.о. Оба класса таких последовательностей

76

содержат сайты связывания регуляторных белков, модулирующих транскрипцию.

Рис. I.5. Межмолекулярные взаимодействия на промоторе РНКполимеразы II

РЭ1–РЭn – последовательности нуклеотидов регуляторных элементов промотора, ФТ1–ФТn – взаимодействующие с ними регуляторные факторы транскрипции, ОФТ – основные факторы транскрипции, КТ – коактиваторы транскрипции, +1 – точка инициации транскрипции

Обобщенная схема промотора РНК-полимеразы II в составе инициационного комплекса представлена на рис. I.5. На ней отображены многочисленные белок–белковые и белково–нуклеиновые взаимодействия при инициации транскрипции. На этой схеме также указано наличие во многих промоторах консервативной последовательности CA, которая находится непосредственно перед нуклеотидом А+1. У некоторых промоторов, в частности ассоциированных с генами домашнего хозяйства, может отсутствовать явно выраженная TATA-последовательность. Проксимальные и дистальные регуляторные элементы промоторов построены из коротких транскрипционных элементов длиной в 10–15 п.о., с которыми непосредственно взаимодействуют факторы транскрипции. Проксимальные регуляторные элементы, как правило, имеют простую структуру, включающую один или несколько транскрипционных элементов (ТЭ). В то же время энхансеры устроены более сложно. Следует заметить, что в активном промоторе дистальные и проксимальные регуляторные элементы сближены друг с другом, в результате чего происходит "выпетливание" разделяющих их протяженных последовательностей ДНК.

Промоторы РНК-полимеразы III. Как уже упоминалось выше, гены, транскрибируемые РНК-полимеразой III, можно разделить на три основных класса (см. рис. I.4,б). К 1-му классу относят гены 5S рРНК, которые содержат

77

внутреннюю регуляторную область (internal control region – ICR). Три элемента ICR, с которыми взаимодействует основной фактор транскрипции TFIIIA, локализованы между нуклеотидами +50 и +64. Комплекс TFIIIA–ICR стабилизируется после взаимодействия с TFIIIA фактора TFIIIC, хотя для последнего в промоторе отсутствует специфический участок связывания (подробнее о факторах транскрипции см. в разделах 2.1.3 и 3.2). Мутации, локализованные в окрестностях точки инициации транскрипции промоторов классов 1 и 2, оказывают сильное влияние на транскрипцию этих генов, что указывает на возможное присутствие в этих промоторах дополнительных регуляторных элементов.

Гены тРНК относят ко второму классу. Для промоторов этих генов характерно наличие внутренних блоков регуляторных последовательностей A и B. Блок А локализован между нуклеотидами +10 и +20, тогда как блок B удален от него на расстояние 30–60 п.о. по направлению к 3’-концу гена. Эти регуляторные элементы узнаются непосредственно фактором TFIIIC, который образует с ними очень прочный комплекс. По крайней мере, четыре полипептидные цепи, входящие в состав комплекса TFIIIC–промотор, контактируют друг с другом и покрывают участок ДНК между положениями –25 и +75. Канонический регуляторный элемент в окрестностях точки инициации транскрипции был локализован путем анализа последовательностей нуклеотидов в соответствующих генах тРНК.

Гены третьего класса кодируют малые ядерные РНК, например U6-РНК у высших эукариот, и содержат только регуляторные элементы, расположенные перед точкой инициации транскрипции. У большинства генов этого класса регуляторные элементы состоят из ТАТА-последовательности с центром в положении –30 и из проксимального элемента PSE (proximal sequence element) с центром в положении –60. Несмотря на наличие ТАТА-элемента, обычно определяющего положение точки инициации транскрипции, в данном случае именно PSE фиксирует положение этой точки. Аналогичную функцию у промоторов РНК-полимеразы II выполняет ТАТА-последовательность. Состав белковых компонентов, образующих комплекс с PSE, в настоящее время до конца не выяснен. Обнаружены два различных PSE-связывающих белковых комплекса, названные SNAP и PTF. Активность промоторов третьего класса зависит от наличия ТАТА-связывающего белка (TBP). Белок ТВР, входящий в

78

состав фактора транскрипции TFIIIB, взаимодействует непосредственно с ТАТА-элементом промотора. Поскольку для инициации транскрипции на этих промоторах требуется наличие PSE-элемента, предполагают, что PSEсвязывающий фактор взаимодействует с ТВР-компонентом фактора TFIIIB. Интересно, что промотор гена U6-РНК животных, узнаваемый РНКполимеразой III, отличается от промотора гена U2-РНК, с которым взаимодействует РНК-полимераза II, только отсутствием ТАТА-элемента U2промотора. У растений оба этих промотора содержат такие регуляторные элементы, а изменение расстояния между ТАТА-элементом и расположенным перед ним регуляторным элементом превращает промотор U6 из Pol IIIзависимого в Pol II-зависимый. Несмотря на наличие у промоторов этих РНКполимераз характерных черт, описанных выше, механизмы, по которым РНКполимеразы II и III различают свои промоторы, остаются невыясненными.

Промоторы РНК-полимеразы I. Несмотря на то, что участки генома, кодирующие рРНК, относятся к одним из наиболее консервативных, регуляторные последовательности, обеспечивающие инициацию транскрипции у разных видов, сильно дивергированы. Одно из объяснений этого явления основывается на факте вхождения рДНК в мультигенное семейство (гены рРНК многократно повторены в геноме). В этой связи мутации в регуляторной области одного гена, которые благоприятно сказываются на его экспрессии, могут быстро распространиться в семействе последовательностей благодаря генной конверсии, неравному кроссинговеру и/или последовательным актам их эксцизии и реинтеграции в геном. В соответствии с этой интерпретацией, промоторные последовательности рДНК обнаруживают мало гомологии даже у таких близких видов, как человек и мышь. Тем не менее, общий план строения промоторов рДНК практически не различается у всех исследованных эукариот. Промоторы РНК-полимеразы I содержат два кόровых регуляторных элемента

(CPE – core promoter element), локализованных между положениями –75 и –50,

а также –30 и +1 (см. рис. I.4, б). Основной промотор лишь слабо связывает TBP-содержащий белковый комплекс SL1 (у людей и крыс), в состав которого, кроме того, входят еще три видоспецифических фактора транскрипции (TBP associated factor – TAF), специфичных в отношении РНК-полимеразы I. Сборка прединициационного комплекса (см. раздел 2.1.3) в этом случае не зависит от специфического взаимодействия TBP и ДНК, так как промоторы РНК-

79

полимеразы I не содержат TATA-последовательности. Как уже упоминалось выше, TAFI63 и TAFI110, входящие в состав комплекса SL1, являются ДНКраспознающими компонентами комплекса. С помощью футпринтинга (см. раздел 7.6.4) было установлено, что комплекс SL1 остается связанным с промотором на протяжении нескольких раундов инициации синтеза РНК РНКполимеразой I. Стабильное взаимодействие комплекса SL1 с промотором требует участия дополнительного ДНК-связывающего белка UBF, который сам по себе обладает способностью слабо связываться с удаленной регуляторной последовательностью UCE (upstream control element), расположенной между нуклеотидами в положениях –90 и –150. Синергизм в стимулирующем действии SL1 и UBF на транскрипцию РНК-полимеразой I может быть обусловлен наличием непосредственных контактов между этими двумя факторами. Другим регуляторным элементом, удаленным от точки инициации транскрипции промотора Pol I, является энхансер, построенный из коротких повторяющихся последовательностей.

Последовательность CPE обеспечивает специфичность транскрипции генов рРНК, и ее достаточно для инициации. В этой связи последовательность UCE и энхансер не рассматриваются в настоящее время как части промотора РНК-полимеразы I. Кроме того, соответствующие промоторы простейших, грибов и растений последовательность UCE не содержат, а белок UBF не является необходимым компонентом бесклеточных систем транскрипции. Как будет подробно рассмотрено ниже, образование прединициационного комплекса РНК-полимеразой II требует участия фактора TFIIB. Аналогичный в функциональном отношении белковый фактор BRF также необходим для инициации транскрипции РНК-полимеразой III. Соответствующий белковый компонент РНК-полимеразы I еще не идентифицирован. Помимо фактора, связывающего кóровую последовательность – CPBF, в инициации синтеза рРНК принимает участие фактор, связывающий энхансер 1, – E1BF (enhancer 1- binding factor), который не входит в состав холофермента Pol I. Оба фактора заметно повышают базальный уровень синтеза рРНК в бесклеточных системах транскрипции.

80

2.1.3. Этапы транскрипции

Процесс транскрипции в настоящее время принято подразделять на 4 основные стадии: 1) связывание молекул РНК-полимеразы с ДНК и распознавание промотора; 2) инициация; 3) элонгация; 4) терминация. Как будет видно из дальнейшего изложения, три последних этапа характерны для биосинтеза большинства других макромолекул клетки, особенно для тех из них, синтез которых является матричным, в частности белков. После связывания с ДНК молекулы РНК-полимеразы осуществляют поиск промоторов, на которых происходит формирование инициационных комплексов. Начальная стадия инициации транскрипции завершается образованием нескольких первых фосфодиэфирных связей в молекуле вновь синтезируемой РНК, после чего транскрипция переходит в стадию элонгации – последовательного удлинения синтезируемых молекул РНК. Стадия элонгации заканчивается по достижении молекулами РНК-полимераз специальных регуляторных последовательностей ДНК, называемых терминаторами транскрипции, после чего происходит освобождение синтезированных молекул РНК и РНК-полимераз из транскрипционных комплексов. Освободившиеся молекулы РНК-полимераз приобретают способность вступать в новый цикл транскрипции. Следует помнить, что четкое разделение единого процесса транскрипции на отдельные стадии условно; оно используется главным образом для удобства описания механизмов биосинтеза РНК и является упрощенной моделью. Основные этапы транскрипции, а также дальнейшие пути реализации генетической информации схематически представлены на рис. I.6.

В обычных условиях холофермент РНК-полимераз эубактерий для инициации транскрипции не требует дополнительных факторов. В отличие от этого для точной инициации транскрипции РНК-полимеразой II требуется наличие, кроме ее субъединиц, еще и основных факторов транскрипции. Синтез РНК, который не зависит от присутствия регуляторных молекул, получил название базальной транскрипции. Транскрипция в клетках является регулируемым процессом, который, как уже упоминалось выше, требует участия белков-активаторов или репрессоров. Белок-активатор (тканеспецифический фактор транскрипции) взаимодействует с регуляторными последовательностями ДНК и активирует синтез РНК. Такая транскрипция