Экспрессия генов Патрушев

211

таких мРНК, и они содержат от одной до шести коротких ОРС, часть из которых может перекрываться. То же самое характерно для мРНК животных. Несмотря на свои малые размеры, короткие ОРС способны обеспечивать инициацию, терминацию и реинициацию трансляции рибосомами эукариот.

Короткие ОРС эукариот играют важную роль в регуляции экспрессии генов на уровне трансляции, о чем подробнее будет говориться в разделе 3.4. Здесь же хочется отметить, что по функциональному признаку короткие ОРС разделяются на две группы: в одних случаях регуляторные функции коротких ОРС не зависят от их кодирующего потенциала, тогда как другие ОРС реализуют свои регуляторные возможности через кодируемые ими пептиды.

В том случае, если короткие ОРС следуют в мРНК друг за другом, рибосомы после завершения трансляции одной из них могут реинициировать синтез белка на следующем инициирующем кодоне. Как и в случае прокариотической трансляции, эффективность реинициации у эукариот в большой степени зависит от расстояния между терминирующим и инициирующим кодоном, а также от нуклеотидного контекста, в котором находится инициирующий кодон.

Инициация на внутренних AUG-кодонах. Третья возможность инициации трансляции у эукариот основана на прямом вхождении рибосом в цикл трансляции независимо от кэп-структур и лидерных последовательностей мРНК при прямом участии их IRES-последовательностей (internal ribosome entry site). В отличие от классической инициации трансляции у прокариот на внутренних AUG-кодонах полицистронных мРНК, обеспечиваемой последовательностями TIR, IRES-опосредованная инициация происходит не на полицистронных мРНК в обычном смысле, т.е. содержащих последовательности нескольких структурных генов. В этой связи полагают, что основная физиологическая роль инициации трансляции на внутренних AUGкодонах эукариот заключается в предоставлении некоторым ОРС возможности транслироваться, минуя основной кэп-зависимый механизм инициации. Например, во время вирусной инфекции протеиназа пикорнавирусов отщепляет от полипептидной цепи клеточного фактора eIFG N-концевой пептид, содержащий сайт связывания фактора eIF4E – основного кэп-связывающего белка эукариот. При этом C-концевая часть такого модифицированного фактора сохраняет сайты связывания факторов eIF3 и eIF4A. В результате

212

происходит (неполное) переключение с кэп-зависимой трансляции мРНК клетки-хозяина на кэп-независимую трансляцию вирусных мРНК, опосредованную IRES-последовательностями вирусов.

2.5.3. Элонгация полипептидных цепей

Элонгация полипептидных цепей в ходе эукариотической трансляции традиционно пользовалась меньшим вниманием исследователей по сравнению с инициацией, поскольку считалось, что ее механизмы в основных чертах идентичны таковым бактерий. Дальнейшие исследования показали, что данная точка зрения в основном соответствует действительности, хотя эукариотическая система трансляции обладает более сложным набором факторов элонгации.

Факторы и механизмы элонгации. Эукариотические клетки содержат в большом количестве фактор элонгации eEF1A, который является функциональным гомологом бактериального фактора EF1A(EF-Tu). Так же как и у бактерий, этот фактор образует тройной комплекс с GTP и аминоацил-тРНК, обеспечивая вхождение последней в А-участок элонгирующей рибосомы. Два других эукариотических фактора eEF1B и eEF2 резко отличаются от бактериальных функциональных аналогов EF1B(EF-Ts) и EF2(EF-G) по аминокислотным последовательностям. Гетеротримерный фактор eEF1B, как и его бактериальный аналог, катализирует обмен GDP на GTP в комплексе eEF1A–GDP. Фактор eEF2, по аналогии с бактериальными системами, обеспечивает транслокацию пептидил-тРНК в P-участок рибосом и перенос деацилированной тРНК в E-участок. У высших организмов этот фактор служит мишенью регуляторных воздействий через фосфорилирование (см. раздел 3.4). Замечательным свойством факторов eEF1A и eEF2 является способность связываться с компонентами цитоскелета эукариотических клеток. Полагают, что это их свойство может обеспечивать один из механизмов внутриклеточного транспорта мРНК, направляющих ее в полисомы.

Растущий полипептид выводится в цитоплазму через канал, начало которого расположено на поверхности рибосомы, где он взаимодействует с белками, распознающими сигнальную последовательность, или с другими цитоплазматическими факторами, которые обеспечивают его направленный транспорт внутри эукариотической клетки. У бактерий растущая полипептидная

213

цепь может вызывать уменьшение скорости элонгации, а природа предпоследней аминокислоты оказывает сильное влияние на терминацию трансляции. Предполагают, что такого рода эффекты являются следствием взаимодействия между строящимся пептидом и факторами трансляции, рРНК или непосредственно каналом, через который он переносится к поверхности рибосомы. Подобные механизмы, по-видимому, функционируют и у эукариот. У дрожжей, как и у E. coli, скорость элонгации трансляции снижается в присутствии редко встречающихся кодонов в мРНК. Наличие определенного числа таких кодонов вблизи сайта инициации трансляции значительно снижает скорость считывания соответствующих ОРС. На скорость декодирования мРНК рибосомами оказывают влияние и характер фолдинга строящихся полипептидных цепей (см. раздел 3.6.1), а также сигнальные последовательности аминокислот, определяющие направление их посттрансляционного транспорта внутри эукариотических клеток.

Уникальный фактор элонгации eEF-3 дрожжей. Клетки дрожжей и других грибов обладают дополнительным фактором элонгации eEF3, аналог которого пока не обнаружен у животных. Фактор является мономерным белком с молекулярной массой 116 кДа, обладающим ATPазной активностью. Функциональная роль этого фактора заключается в стимуляции вхождения тройного комплекса eEF1A•аа-тРНК•GTP в А-участок элонгирующей рибосомы, что является следствием его стимулирующего влияния на освобождение деацилированной тРНК из Е-участка рибосомы. Освобождение деацилированной тРНК сопряжено с гидролизом ATP, катализируемым этим фактором. Несмотря на то что рибосомы животных обладают АТРазной активностью, гидролиз АТР для трансляции, осуществляемой этими рибосомами, не требуется.

Благодаря своей уникальности, фактор eEF3 активно исследуется фармацевтическими компаниями как потенциальная мишень для противогрибковых препаратов.

2.5.4.Терминация трансляции

Вэукариотических белоксинтезирующих системах терминация трансляции, как и у бактерий, контролируется специфическими рилизинг-

214

факторами. Однако у эукариот эти факторы менее разнообразны. В частности, у них отсутствует функциональный аналог бактериального фактора RRF/RF4.

Факторы терминации. По современным представлениям, элонгирующая эукариотическая рибосома распознает стоп-кодоны, находящиеся в одной рамке с основными ОРС, после взаимодействия с гетеродимерным комплексом рилизинг-факторов (RF), в состав которого входят факторы eRF1 и eRF3. Фактор eRF1 необходим для распознавания всех трех терминирующих кодонов (UAA, UAG и UGA) и освобождения синтезированного полипептида. Фактор eRF3 является GTPазой, обладающей гомологией с eEF1A, которая, гидролизуя GTP, стимулирует терминацию независимо от последовательности нуклеотидов в терминирующих кодонах.

Влияние нуклеотидного контекста на эффективность терминации.

Два основных фактора оказывают влияние на эффективность терминации трансляции у эукариот. Этими факторами являются последовательности нуклеотидов в окрестностях терминирующих кодонов и структура C-концевой части строящейся полипептидной цепи. Терминирующие кодоны дрожжей по частоте их использования можно расположить в следующий ряд: UAA(53%) > UGA(27%) > UAG(20%). Если анализировать только активно экспрессирующиеся гены, то частота использования UAA оказывается еще большей – 87%. Анализ последовательностей нуклеотидов в окрестностях терминирующих кодонов показал, что и они не являются случайными. Путем исследования способности следующего за стоп-кодоном нуклеотида изменять эффективность его супрессии в гене lacZ было установлено их следующее влияние на усиление терминации трансляции на соответствующих терминирующих кодонах: G>U>A>C (UGA), G>A>U>C (UAA) и A>U>C>G (UAG).

Третий от стоп-кодона нижерасположенный нуклеотид оказывает лишь слабое влияние на эффективность терминации. Эти и другие такого рода данные были интерпретированы в пользу участия следующего за стоп-кодоном нуклеотида во взаимодействии eRF-факторов с терминирующей рибосомой.

Результаты исследования возможной роли нуклеотидов, предшествующих терминирующему кодону, в терминации трансляции интерпретировать труднее, так как соответствующие замены могут непосредственно изменять первичную структуру С-концевой последовательности строящихся полипептидов. Такие эффекты были

215

обнаружены у E. coli: по крайней мере, две последние аминокислоты оказывают влияние на эффективность терминации синтеза соответствующего белка. У этой бактерии перед кодоном UGA чаще встречаются кодоны UCC(Ser), а также UUC и UUU(Phe), в то время как перед кодоном UUA – кодон AAG(Lys). Эти особенности объясняют возможным участием пептидил-тРНК, находящейся в P-участке рибосом, или самой С-концевой аминокислоты в функционировании RF-факторов в A-участке. Зависимость терминации от природы аминокислот в С-концевой части строящегося полипептида была прямо продемонстрирована для E. coli и дрожжей.

2.5.5. Трансляция в митохондриях

Митохондрии являются органеллами эукариотических клеток, в которых в результате окислительного фосфорилирования энергия химических связей, освобождающаяся при метаболизме, накапливается в виде энергии макроэргических связей ATP. Эти органеллы обладают собственным геномом – двухцепочечной ковалентно замкнутой митохондриальной ДНК (мтДНК), которая присутствует в каждой митохондрии в виде нескольких идентичных копий. В настоящее время наибольшее распространение получила гипотеза об эндосимбиотическом происхождении митохондрий, в соответствии с которой современные митохондрии животных берут свое начало от α-протеобактерий (к которым принадлежит современная Rickettsia prowazekii), внедрившихся в цитозоль клеток-предшественников. Считается, что за время эндосимбиоза бактерии передали большую часть своих жизненно важных генов хромосомам клетки-хозяина, сохранив в своем геноме (в случае клеток человека) информацию лишь о 13 полипептидах, 22 тРНК и двух рРНК. Все полипептиды входят в состав ферментативных комплексов системы окислительного фосфорилирования митохондрий.

Как уже можно видеть из размера мтДНК (ее длина у человека составляет 16569 п.о.), митохондрии не являются самовоспроизводящимися генетическими системами. Репликация и транскрипция их генома зависят от транс-действующих факторов, кодируемых ядерным геномом. Все митохондриальные тРНК акцептируют аминокислотные остатки при участии аминоацил-тРНК-синтетаз, импортируемых в митохондрии из цитоплазмы. В цитоплазме же клеток позвоночных синтезируются все рибосомные белки

216

митохондрий, мРНК которых транскрибируются с ядерных генов. Даже происхождение белков комплексов системы окислительного фосфорилирования является смешанным – ядерно–митохондриальным. Все полипептиды, кодируемые ядерным геномом, синтезируются рибосомами цитозоля. Как правило, они обладают N-концевой отщепляемой сигнальной последовательностью, которая обеспечивает направленный перенос в митохондрии.

Декодирование генетической информации в митохондриях.

Сравнение первичной структуры мтДНК с последовательностями аминокислот митохондриальных белков выявило ряд особенностей генетического кода, используемого митохондриями. Имеются вариации и в частоте использования кодонов митохондриями разных видов. В мтДНК большинства филогенетических групп триплет TGA кодирует Trp, хотя обычно на нем происходит терминация синтеза полипептидных цепей. С другой стороны, кодон AGR (где R=A или G) в мтДНК позвоночных является терминирующим, у иглокожих кодирует Ser, а у дрожжей, как обычно, – Arg.

Другой характерной особенностью генетической системы митохондрий является упрощение самого механизма декодирования информации, заключенной в митохондриальной мРНК. Интересно, что трансляция всех кодонов в митохондриях происходит с участием далеко не всех 32 видов молекул тРНК, которые обычно требуются для осуществления биосинтеза белка в соответствии с гипотезой неоднозначного соответствия Крика. Например, лишь 22 видов молекул тРНК достаточно для трансляции всех мРНК 13 генов мтДНК человека. Это становится возможным благодаря использованию основания U в первом (wobble) положении антикодона тРНК одного вида для распознавания всех четырех кодонов каждого из семейств, кодирующих конкретную аминокислоту.

Миторибосомы. Одним из первых указаний на прокариотическое происхождение митохондрий было отличие набора антибиотиков, подавляющих трансляцию в этих органеллах, от антибиотиков, которые ингибируют биосинтез белка в цитозоле клеток эукариот. Дальнейшие исследования показали, что некоторые компоненты системы трансляции митохондрий гомологичны соответствующим компонентам бактериальных систем.

217

Рибосомы митохондрий, или миторибосомы, ассоциированы с митохондриальным матриксом. На основании определения стационарного уровня митохондриальных рРНК в гепатоцитах крыс было установлено, что отдельная митохондрия содержит <100 миторибосом. Структурные исследования миторибосом выявили их существенные отличия от цитоплазматических и бактериальных рибосом. Для миторибосом животных характерно очень низкое содержание РНК и, как следствие, более низкий коэффициент седиментации (~55S). Коэффициенты седиментации большой и малой субчастиц миторибосом составляют соответственно ~39S и ~28S, которые содержат в своем составе 16S и 12S рРНК. Небольшая 5S рРНК, характерная для обычных рибосом, в миторибосомах отсутствует. Тем не менее, участок 3'-конца 16S рРНК миторибосом человека длиной в 23 нуклеотида обнаруживает 68% гомологию с 5S рРНК Bacillus subtilis. Полагают, что эта часть 16S рРНК представляет собой укороченный функциональный аналог 5S рРНК бактериальных рибосом.

Низкая массовая доля РНК в миторибосомах компенсируется повышенным содержанием белков. В результате суммарная молекулярная масса миторибосом приближается к таковой рибосом бактерий. Полагают, что часть белков миторибосом могла взять на себя функции недостающих последовательностей рРНК. С помощью двумерного электрофореза удается обнаруживать 85 (быки) или 86 (крысы) миторибосомных белков. Тем не менее, истинное количество белков, составляющих миторибосомы, остается неизвестным, поскольку часть электрофоретически выявляемых полипептидов может представлять собой продукты протеолитической деградации или быть предшественниками их зрелых форм.

Биосинтез белка в митохондриях. Несмотря на то что изолированные митохондрии активно синтезируют белок, до сих пор из них не удается получить эффективные бесклеточные системы трансляции. Это сдерживает исследование молекулярных механизмов трансляции в митохондриях, и имеется мало информации относительно факторов трансляции, участвующих в синтезе митохондриальных белков.

Трансляция в митохондриях уникальна во многих отношениях. Как уже упоминалось, одной из особенностей биосинтеза белка в митохондриях является малое число видов рРНК и тРНК, вовлеченных в этот процесс.

218

Остается непонятным, каким образом миторибосомы распознают инициирующие кодоны. Поскольку митохондриальные мРНК лишены 5'UTR, которые характерны для бактериальных и ядерных мРНК, взаимодействие миторибосом с инициирующими кодонами должно определяться другими принципами, отличающимися от сканирования цитоплазматическими рибосомами эукариот или от взаимодействий TIR-последовательностей мРНК с 16S рРНК у бактерий. Обнаруженная низкая эффективность трансляции митохондриальных мРНК in vitro может быть следствием строения их 5'- концевых последовательностей, и для осуществления биосинтеза митохондриального белка на приемлемом уровне требуется присутствие мРНК

ввысоких концентрациях, что и имеет место в нативных митохондриях.

Вбесклеточных системах было показано, что 28S субчастица миторибосом обладает способностью прочно связываться с мРНК независимо от последовательности нуклеотидов в отсутствие дополнительных факторов и инициаторной тРНК, что отличает ее от субчастиц других про- и эукариотических рибосом. Для ее эффективного взаимодействия с мРНК длина полинуклеотида должна быть ~400 нуклеотидов, тогда как сама субчастица защищает от действия РНКазы T1 участок мРНК длиной в 30–80 нуклеотидов. Возможно, это объясняет, почему самые короткие ОРС мтДНК являются перекрывающимися, так как благодаря такому строению соответствующие мРНК приобретают размеры, необходимые для оптимального взаимодействия

смалой субчастицей миторибосом. Полагают, что после взаимодействия с мРНК малая субчастица при участии еще не идентифицированных факторов трансляции перемещается к инициирующему кодону на 5'-конце матрицы.

Внастоящее время единственным охарактеризованным митохондриальным фактором инициации трансляции является mtIF2, который обеспечивает GTP-зависимое вхождение инициаторной формилметионил-тРНК (fMet-тРНК) в комплекс, образованный малой субчастицей миторибосом и мРНК. Вероятно, гидролиз GTP сопровождается освобождением mtIF2 из тройного комплекса с последующим соединением малой и большой (39S) субчастиц миторибосом с образованием комплекса, способного к элонгации полипептидных цепей.

Из печени быка были выделены три фактора элонгации трансляции: mtEF-Tu, mtEF-Ts и mtEF-G, которые обладают высокой гомологией с

219

соответствующими прокариотическими факторами. На этом основании полагают, что механизм элонгации строящихся полипептидных цепей в митохондриях в основных чертах соответствует таковому E. coli, уже подробно рассмотренному выше. В отличие от бактериальных факторов EF-Tu и EF-Ts соответствующие факторы митохондрий образуют друг с другом более прочный комплекс, для диссоциации которого недостаточно присутствия только GTP, однако комплекс диссоциирует при наличии в бесклеточных системах GTP и аминоацилированной тРНК.

Патологические последствия мутационных повреждений системы трансляции митохондрий. Точковые мутации, обнаруживаемые в мтДНК, как правило, являются гетероплазматическими, т.е. в одной и той же клетке присутствуют как нормальные, так и мутантные мтДНК. Именно это явление позволяет существовать клеткам с мтДНК, содержащими летальные мутации, которые в обычных условиях были бы элиминированы. Энцефаломиопатии, для которых характерен материнский тип наследования (с цитоплазмой яйцеклетки), часто вызываются точковыми мутациями в генах митохондриальных тРНК. В частности, такими патологическими последствиями сопровождаются транзиции A3243G и A8344G в генах тРНКLeu(UUR) и тРНКLys соответственно. Предполагается, что в первом случае нарушается правильный процессинг первичного полицистронного транскрипта, что приводит к образованию гибридной молекулы с последовательностями 16S рРНК– тРНКLeu(UUR)–ген ND1, которая, из-за присутствия в ней последовательности 16S рРНК, включается в нефункциональную субчастицу рибосом. Альтернативно, обсуждаемые мутации могут дестабилизировать молекулы тРНК.

2.5.6. Трансляция в хлоропластах.

Хлоропласты являются органеллами клеток растений, осуществляющих процесс фотосинтеза – преобразование энергии квантов света в энергию макроэргических связей ATP. Так же как и митохондрии, хлоропласты обладают собственным геномом, представленным множественными копиями кольцевой ковалентно замкнутой ДНК (хпДНК – ctDNA), длина которой обычно составляет ~150 т.п.о. Геном хлоропластов заключает в себе более 100 различных генов. В соответствии с теорией эндосимбиоза хлоропласты произошли от

220

цианобактерии Anacystis nidulans (Synechococcus PCC6301), которая в ходе адаптации к внутриклеточному существованию передала основную часть своих генов хромосомам ядра клетки-хозяина. В результате образовавшийся хлоропласт стал зависимым от ядра в отношении биосинтеза импортируемых хлоропластных белков и генетического контроля экспрессии собственных генов. Как и митохондрии, хлоропласты обладают собственной системой транскрипции и трансляции, а также репликации хпДНК.

В отличие от митохондрий животных, система трансляции хлоропластов высоко гомологична системе бактерий и представлена 70S рибосомами, собственными тРНК и аминоацил-тРНК-синтетазами, многочисленными факторами трансляции и т.п. Геном хлоропластов содержит гены всех рРНК (16S, 23S и 5S), которые кластеризованы и транскрибируются полицистронно. В большой субчастице рибосом хлоропластов рРНК 23S-типа часто представлена двумя или четырьмя фрагментами. Так, в рибосомах Chlamydomonas eugametos она представлена четырьмя фрагментами длиной 280 (α-фрагмент), 52 (β), 810 (γ) и 1720 (δ) нуклеотидов. Вторичная структура этих фрагментов практически идентична предсказанной структуре соответствующих участков 23S рРНК E. coli. На этом основании делается вывод, что физическая непрерывность молекулы 23S рРНК не существенна для ее функционирования.

70S рибосомы хлоропластов содержат ~60 рибосомных белков, что превышает их содержание (55 полипептидов) в рибосомах E. coli. Приблизительно 1/3 рибосомных белков кодируется хпДНК, а 2/3 – ядерным геномом. Рибосомы хлоропластов высших растений содержат, по крайней мере, пять белков, не имеющих гомологов в рибосомах E. coli.

Геномы хлоропластов, для которых определена полная первичная структура, содержат 27–35 потенциальных генов тРНК. При этом в геноме для кодирования полипептидов используются все теоретически возможные кодоны (61). Это приводит к ситуации, характерной и для митохондрий, – у хлоропластов отсутствует полный набор тРНК, необходимых для декодирования этих кодонов. В данном случае проблема, по-видимому, решается так же, как и у митохондрий: индивидуальные тРНКPro(UGG), тРНКAla(UGC) и тРНКArg(ACG) распознают по четыре кодона, которые кодируют каждую из аминокислот, акцептируемых соответствующими молекулами тРНК (в скобках представлены последовательности антикодонов тРНК).