Экспрессия генов Патрушев

231

строгого ответа (stringent response). Первичной сигнальной молекулой строгого ответа является гуанозинтетрафосфат – ppGpp, который уменьшает скорость элонгации РНК-полимеразой и вызывает преждевременную терминацию транскрипции в rrnB-опероне.

Транскрипция оперонов рибосомных белков также контролируется на уровне элонгации. В частности, у E. coli транскрипция оперона, кодирующего рибосомный белок S10 и десять других рибосомных белков, контролируется через задержку транскрипции, для реализации которой используется продукт третьего гена оперона – рибосомный белок L4. Этот белок взаимодействует со шпилькой синтезируемой РНК, вызывая преждевременную терминацию транскрипции в лидерном участке гена S10 – первом гене оперона. В отличие от классической аттенюации альтернативные вторичные структуры РНК в этом случае не являются причиной изменения эффективности транскрипции соответствующего участка ДНК. Белок L4 связывается со шпилькой на 70–80 нуклеотидов выше сайта терминации транскрипции. Шпилька в синтезируемой РНК образуется выше сайта терминации независимо от присутствия белка L4, однако без него молекула РНК-полимеразы не замечает сигнала терминации транскрипции. Этот механизм предотвращает накопление в клетке свободных рибосомных белков, не включившихся в состав рибосомных субчастиц.

Транскрипция оперона биосинтеза пиримидинов у E. coli регулируется как на уровне элонгации, так и на этапе освобождения промотора. Первый тип регуляции является еще одним примером классической аттенюации, тогда как во втором случае реализуется нетривиальный механизм. Оперон индуцируется в присутствии низких внутриклеточных концентраций UTP. При повышении ее содержания транскрипционный комплекс продолжает эффективно формироваться на промоторе, однако во время инициации РНК-полимераза начинает реитеративный синтез гомополимера. Синтезируются длинные цепи поли(U), а в продуктивную фазу синтеза РНК фермент не вступает, потому что не может покинуть промотор. Недавно тот же механизм контроля был описан для оперона codBA E. coli. По мнению М. Чамберлина (1997 г.) аналогичный механизм может функционировать и у эукариот.

В отличие от только что рассмотренного механизма контроля пиримидинового оперона регуляция транскрипции оперона purB E. coli осуществляется на уровне элонгации РНК с помощью пуринового репрессора –

232

ДНК-связывающего белка, взаимодействующего со специфической последовательностью нуклеотидов. Оперон purB является одним из девяти purоперонов, и два других гена также контролируются пуриновым репрессором. Однако только в опероне purB репрессор взаимодействует с ДНК значительно ниже сайта инициации транскрипции и создает препятствие элонгирующей РНК-полимеразе. Этот эффект не зависит от purB-промотора и не сопряжен с трансляцией.

У B. subtilis регуляция транскрипции оперонов биосинтеза пуринов и пиримидинов также связана с задержкой синтеза РНК, однако используемый при этом механизм отличается от такового у E. coli. В этом случае первичными регуляторами транскрипции являются уже не рибосомы, а новые белки, которые распознают другие элементы вторичной структуры РНК. В частности, было предсказано образование альтернативных шпилек в РНК пуринового оперона под действием РНК-связывающего белка, ассоциированного с гуанином. Реализуемый механизм оказался аналогичным механизму репрессии биосинтеза триптофана, о котором подробнее речь пойдет ниже.

Из общих соображений можно предположить, что биосинтез предшественников РНК, необходимых для синтеза пуринов и пиримидинов, должен оказывать прямое влияние на транскрипцию через изменение уровней соответствующих нуклеотидов. Действительно, у дрожжей, дефектных по фактору элонгации EFIIS, стимулирующему элонгацию РНК у эукариот, наблюдается повышенная чувствительность к 6-азаурацилу, который уменьшает внутриклеточный пул GTP и UTP. К такому же фенотипу приводили и некоторые мутационные изменения субъединиц РНК-полимеразы II S. cerevisiae. Для некоторых, хотя и не для всех мутантных РНК-полимераз этого типа, были характерны нарушения в элонгации транскриптов или взаимодействии с факторами элонгации in vitro. Все это еще раз указывает на универсальный характер тонкой координации в клетках метаболизма нуклеотидов и синтеза РНК.

Регуляция транскрипции не всех бактериальных оперонов биосинтеза аминокислот у бактерий следует сценарию аттенюации, характерному для trp-, his-, leu- и ilv-оперонов E. coli. В частности, транскрипция trp-оперона B. subtilis также регулируется на уровне элонгации, однако в этом случае в регуляции участвует РНК-связывающий белок TRAP, который, кроме того,

233

взаимодействует с триптофаном. После образования комплекса с триптофаном белок TRAP приобретает способность связываться с РНК оперона в ее лидерном участке. Такое взаимодействие модифицирует вторичную структуру РНК, что способствует терминации транскрипции. Более того, белок TRAP может оказывать негативное влияние на трансляцию полицистронной мРНК оперона при повышении внутриклеточного содержания триптофана. В отличие от E. coli на процесс транскрипции trp-оперона у B. subtilis рибосомы не оказывают прямого влияния.

Сопряжение транскрипции и репарации ДНК. Многие повреждения ДНК вызывают прекращение элонгации транскриптов у бактерий и эукариот, вызывая переход элонгирующего транскрипционного комплекса в неактивное состояние. При этом преимущественно репарируются транскрибируемые цепи ДНК. Обнаружены белковые факторы, осуществляющие сопряжение транскрипции с репаративным синтезом ДНК. В частности, бактериальный белковый комплекс UvrAB, участвующий в репаративной эксцизии (вырезании) нуклеотидов (NER – см. раздел 5.2.2), может непосредственно взаимодействовать с β-субъединицей РНК-полимеразы, а также с одноцепочечными участками ДНК в составе открытых промоторных и тройных элонгирующих комплексов. У E. coli некоторые из этих воздействий обеспечивают контакты между молекулами РНК-полимеразы, прекратившей элонгацию цепей РНК, и репарирующим комплексом, который с помощью фактора, сопрягающего транскрипцию и репарацию, выводит элонгирующий комплекс из состояния прекращения транскрипции. Не все повреждения ДНК оказывают влияние на элонгацию транскриптов РНК-полимеразой. Например, РНК-полимеразы как фага SP6, так и E. coli эффективно преодолевают в ДНК бреши, не содержащие азотистых оснований. При прохождении таких участков ДНК молекулы РНК-полимераз обычно включают остатки AMP в элонгируемую РНК независимо от матрицы.

Контроль элонгации РНК у бактериофагов. Во время вирусной инфекции размножающиеся вирусы овладевают контролем над экспрессией генов клетки-хозяина и используют ее для своих собственных нужд, что является общим свойством всех внутриклеточных паразитов и симбионтов. Многие из бактериофагов осуществляют контроль транскрипции на уровне элонгации.

234

Бактериофаг λ. Механизмы контроля транскрипции на уровне элонгации РНК у этого бактериофага изучены лучше, чем у других вирусов. Ключевые регуляторные фаговые белки N и Q контролируют транскрипцию всего фагового генома, обеспечивая антитерминацию транскрипции в местах обычного прекращения синтеза вирусных РНК, т.е. на терминаторах транскрипции. В результате происходит транскрипция всех генов, необходимых для размножения бактериофага, и он вступает на вирулентный путь развития, приводящий к лизису бактериальных клеток и выходу зрелых фаговых частиц в окружающую среду. Механизм антитерминации, обеспечиваемой N-белком, отличается от механизма Q-зависимой антитерминации. N-Белок осуществляет свои функции при прохождении элонгирующей РНК-полимеразой особых последовательностей ДНК (бокс А и бокс В), обеспечивающих сборку комплекса элонгирующей РНК-полимеразы и N-белка. Белок N сам по себе является РНКсвязывающим белком, и его взаимодействие с РНК стабилизируется Nusбелками E. coli. Его объединение с РНК и комплексом сопутствующих белков заставляет элонгирующую РНК-полимеразу не замечать сигналы терминации на ДНК, как зависимые, так и не зависимые от факторов терминации транскрипции.

Во время антитерминации транскрипции, опосредуемой Q-белком, последний взаимодействует с нетранскрибируемой цепью ДНК промоторного или элонгирующего комплексов в пределах первых 20–25 нуклеотидов ниже точки инициации транскрипции позднего фагового промотора. При этом белок Q не образует комплекса с РНК и оказывает свое действие на транскрипцию через регуляторную субъединицу РНК-полимеразы σ70. Для реализации Q- зависимой антитерминации in vivo необходимо, чтобы произошла задержка в перемещении элонгирующей РНК-полимеразы вдоль матрицы вскоре после инициации транскрипции. В это время уже освободившаяся из транскрипционного комплекса σ-субъединица входит в контакт с нетранскрибируемой цепью ДНК в открытом участке (транскрипционном пузырьке), расположенном на 15 нуклеотидов ниже точки инициации транскрипции. Таким образом, σ-субъединица остается ассоциированной с транскрибирующим комплексом и опосредует антитерминирующее действие Q- белка на больших расстояниях (несколько тысяч пар оснований) от промотора.

235

В этом случае совместное действие фактора инициации транскрипции (σ- субъединицы) и ДНК-связывающего белка-антитерминатора изменяют свойства элонгирующей РНК-полимеразы, которая освобождает промотор после кратковременной паузы в элонгации. Эти необычные свойства σ-субъединицы, проявляемые во время вирусной инфекции, позволяют высказывать предположение о ее возможном участии в контроле транскрипции бактериальных генов на уровне освобождения промотора и элонгации синтеза РНК.

Лямбдоидный бактериофаг HK022. При заражении клеток E. coli этим бактериофагом происходит исключение (подавление развития) фага λ, в котором участвует вирусный белок nun. Этот белок, родственный белку N фага λ, также участвует в контроле элонгации РНК у бактериофага HK022. Во время

λ-инфекции Nun-белок нарушает функционирование N-белка, предотвращая антитерминацию синтеза РНК и вызывая его терминацию. При этом оба белка взаимодействуют с одними и теми же последовательностями РНК, однако оказывают противоположное действие на элонгирующий транскрипционный комплекс. Бактериофаг HK022 обладает собственной регуляторной системой антитерминации транскрипции, для функционирования которой не требуется белок Nun, но необходима его мРНК. В этом случае элонгирующий комплекс перестает узнавать терминаторы транскрипции после прямого взаимодействия Nun-РНК с β’-субъединицей РНК-полимеразы. Для осуществления антитерминации по такому механизму не требуется участия других вирусных белков.

Бактериофаг Т4. Бактериофаг Т4 использует бактериальную РНКполимеразу для транскрипции своего собственного генома, ингибируя синтез РНК бактериальной клетки-хозяина. В подавлении транскрипции участвует фаговый белок Alc, взаимодействующий с β-субъединицей РНК-полимеразы E. coli, что сопровождается прекращением транскрипции матричных ДНК, содержащих остатки цитозина. Т4-ДНК содержит вместо остатков С остатки 5- гидроксиметилцитозина и эффективно транскрибируется РНК-полимеразой как в присутствии Alc-белка, так и без него. В отличие от этого матричные ДНК, содержащие немодифицированные остатки С, не транскрибируются бактериальной РНК-полимеразой только в присутствии белка Alc, и даже

236

простое метилирование остатков цитозина в положении С5 обеспечивает защиту транскрипции от преждевременной терминации, вызываемой этим белком.

Координация элонгации транскриптов с метаболизмом ДНК.

Транскрипция происходит координированно с репликацией бактериальной ДНК

исегрегацией хромосом в дочерние клетки. Транскрибирующая РНКполимераза часто встречается в процессе синтеза РНК с репликативным бактериальным комплексом. Для сведения к минимуму отрицательного эффекта такой встречи активно транскрибируемые гены E. coli, других бактерий

ибактериофагов ориентированы на хромосомах таким образом, чтобы синтез ДНК и РНК происходил в одном направлении. Но даже в этом случае встреча двух работающих комплексов неизбежна, поскольку репликация ДНК происходит в 10–20 раз быстрее транскрипции тех же ее участков. Теоретически отрицательные последствия такого столкновения заключаются в том, что в отличие от ДНК-полимераз, которые функционируют по дистрибутивному механизму, т.е. способны продолжать синтез ДНК после его временного прекращения и отделения фермента от матрицы, РНК-полимеразы являются процессивными ферментами. Они не могут продолжить синтез РНК после распада элонгирующего комплекса и для вовлечения в новый цикл транскрипции требуют инициации синтеза РНК на промоторе. При этом энергия, затраченная на синтез недостроенного фрагмента РНК, безвозвратно теряется. Данная проблема особенно актуальна для больших эукариотических генов, например гена дистрофина, размер которого превышает 2000 т.п.о. Тем не менее, методом электронной микроскопии показано, что у E. coli репликативная вилка может смещать с ДНК элонгирующий транскрипционный комплекс. Установлено также, что элонгация транскриптов оказывает влияние на правильную терминацию репликации.

Убактериофага Т4 репликативный аппарат может функционировать без разрушения элонгирующих транскрипционных комплексов независимо от направления транскрипции по отношению к направлению синтеза ДНК. В опытах Б. Лиу и Б.М. Албертса (1995 г.) с высокоочищенными компонентами аппаратов транскрипции и репликации бактериофага Т4 было установлено, что при одновременно происходящих транскрипции и репликации оба работающих комплекса не мешают друг другу выполнять свои функции. При прохождении

237

репликативной вилки через транскрибируемый участок ДНК этого вируса положение РНК-полимеразы на матрице не изменяется. Во время контакта работающей репликативной вилки с РНК-полимеразой в составе тройного комплекса не было обнаружено изменений его стабильности как во время активного синтеза РНК, так и в состоянии задержки транскрипции. Неожиданно оказалось, что при столкновении репликативного и транскрипционного комплексов друг с другом РНК-полимераза переключается на использование в качестве матрицы вновь синтезированной дочерней цепи ДНК. Во время такой смены матриц РНК-полимераза сохраняет связь с растущим транскриптом, остается в активном состоянии и продолжает безошибочно синтезировать правильную цепь РНК. Этот пример указывает на возможный механизм координации репликации и транскрипции у других, более сложноустроенных организмов.

Белковые факторы, регулирующие элонгацию РНК у бактерий.

Белковые факторы и небольшие молекулы, изменяющие свойства элонгирующих РНК-полимераз, столь же разнообразны, как и упомянутые выше механизмы регуляции транскрипции на уровне элонгации РНК. Это особенно относится к эукариотам, о которых речь пойдет в следующем разделе книги. Некоторые факторы стимулируют элонгацию через супрессию временной задержки РНК-полимераз на транскрибируемых матрицах или путем активации комплексов, полностью прекративших транскрипцию. Другие факторы обеспечивают терминацию или антитерминацию транскрипции. У эукариот имеются белки, изменяющие активность белковых компонентов элонгирующих комплексов, а также структуру транскрибируемого хроматина. Некоторые регуляторные белки осуществляют свое действие, связываясь непосредственно с растущим транскриптом или матричной ДНК, другие – через белок–белковые взаимодействия. Во многих случаях механизм действия регуляторных белков остается невыясненным.

У E. coli имеются уже упоминавшиеся выше белковые факторы GreA и GreB, которые выводят элонгирующий комплекс РНК-полимеразы из состояния полного прекращения синтеза РНК путем стимуляции эндонуклеазного отщепления 3’-концевой части элонгируемого транскрипта. Ген, кодирующий белок GreA, впервые был обнаружен генетическими методами как генсупрессор температурно-чувствительной мутации в β’-субъединице РНК-

238

полимеразы E. coli. Инактивация генов greA или greB по отдельности с помощью мутаций не сопровождается выраженным изменением фенотипа мутантных бактерий, однако двойная мутация делает бактериальные клетки температурно-чувствительными. Для таких мутантных клеток была характерна быстрая реверсия к обычному нетемпературно-чувствительному фенотипу. На этом основании делается вывод о значительном преимуществе в росте бактериальных клеток, обладающих функциональными белками GreA и GreB, даже при пермиссивной температуре. Те же генетические свойства характерны и для фактора элонгации транскрипции TFIIS(SII) S. cerevisiae – функционального (но не структурного) гомолога вышеупомянутых бактериальных факторов.

Среди регуляторов элонгации транскрипции, действующих по типу терминации–антитерминации синтеза РНК, для полноты картины следует упомянуть уже обсуждавшиеся выше фактор терминации транскрипции ρ, а

также белки-антитерминаторы транскрипции N и Q бактериофага λ.

3.2. Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот

Несмотря на то что основные принципы регуляции транскрипции генов у прокариотических и эукариотических организмов остаются неизменными – через специфические взаимодействия белков и нуклеиновых кислот друг с другом, а также между собой, данный процесс у эукариот характеризуется рядом существенных особенностей. Это связано, прежде всего, с необходимостью поддержания координированной экспрессии эукариотических генов в более сложноорганизованной генетической системе. Достаточно вспомнить, что в организме человека гистологически различают, по крайней мере, 100 типов клеток, формирующих его органы и ткани. Для любого типа клеток характерен свой уникальный набор экспрессирующихся генов, которые начинают функционировать во время дифференцировки клетокпредшественников. Кроме того, сам процесс формирования органов и тканей сопровождается пролиферацией строго определенных групп клеток, а также упорядоченным во времени и пространстве перемещением клеток. Все эти особенности жизнедеятельности клеток высших организмов обеспечиваются функционированием их генов.

239

Гены высших организмов подразделяют по функциональному признаку на две большие группы: "гены домашнего хозяйства" (housekeeping genes) и "гены роскоши" (luxury genes). К первой группе относятся гены, функционирующие повсеместно, на всех стадиях жизненного цикла организма. Они обеспечивают процесс гликолиза, биосинтез аминокислот и нуклеотидов, катаболизм белков и т.п. Гены, относящиеся ко второй группе, экспрессируются лишь в специализированных клетках и являются маркерами дифференцированных состояний этих клеток.

Сложность жизненного цикла многоклеточных организмов накладывает свои требования на особенности функционирования их генов. В частности, большое число генов и даже целые блоки их функционируют лишь на определенных стадиях эмбриогенеза и не транскрибируются в клетках взрослого организма. У человека к ним относятся, например гены α- фетопротеина. Экспрессия этих генов в клетках взрослого организма свидетельствует о развитии патологического процесса, в частности злокачественных новообразований в печени. Еще более ярким примером такого рода является избирательная инактивация одной из X-хромосом у самок млекопитающих.

Тканеспецифический характер экспрессии генов роскоши обеспечивается различными механизмами. В этом случае ключевую роль играют специфические взаимодействия белковых факторов транскрипции с регуляторными последовательностями нуклеиновых кислот. Транскрипцию генов высших организмов осуществляют, по крайней мере, три различные РНКполимеразы. При этом для промоторов каждой из них характерны специфические регуляторные последовательности нуклеотидов, с которыми взаимодействуют свои факторы транскрипции, изменяющие уровень транскрипции соответствующих генов (см. рис. I.4).

В свою очередь, сами эукариотические факторы транскрипции реализуют новый, известный (в таком масштабе) только у эукариот механизм регуляции экспрессии генов на уровне транскрипции так называемого комбинаторного типа. Молекулы факторов транскрипции обладают консервативными доменами, которые дают им возможность осуществлять высокоспецифические белокбелковые и белково-нуклеиновые взаимодействия. В результате, in vivo происходит объединение факторов транскрипции и других регуляторных

240

белков, обладающих соответствующими доменами, в разных сочетаниях в большие регуляторные комплексы. Каждое новое сочетание факторов, число которых хотя и велико, но ограничено, придает комплексу уникальные регуляторные свойства, обеспечивая изменение специфичности его взаимодействия с регуляторными последовательностями ДНК и другими регуляторными белками аппарата транскрипции. В результате реализации такого механизма достигается беспрецедентная гибкость в модуляции уровней транскрипции эукариотических генов и соответственно в контроле экспрессии фенотипических признаков клетки и организма.

Не менее уникальна способность эукариот использовать для регуляции транскрипции своих генов изменения структуры хроматина. С помощью таких эффективных механизмов осуществляется репрессия и дерепрессия генов во время дифференцировки клеток, и соответствующее функциональное состояние отдельных генов, их больших массивов и даже целых хромосом может поддерживаться на протяжении всей жизни организма. Перестройки хроматина в окрестностях регуляторных участков генов происходят и в связи с более тонкой регуляцией их транскрипции.

Несмотря на то что изменение уровней транскрипции генов является одним из важнейших способов регуляции их экспрессии, такая стратегия – лишь одна из многих, используемых эукариотическими организмами для контроля биосинтеза, содержания и функционирования соответствующих продуктов генов: белков или нуклеиновых кислот. В процессе синтеза и после его завершения первичный транскрипт подвергается многочисленным посттранскрипционным модификациям и процессингу. Таким образом, генетической информации, заключенной в конкретном гене, недостаточно для полноценной экспрессии, и чтобы ген правильно функционировал, требуется координированная работа дополнительных генов, многие из которых активны не вблизи регулируемых генов, а в других тканях, удаленных от клетокмишеней. Для осуществления такой передачи регуляторных сигналов на большие расстояния в организме присутствуют специальные системы, осуществляющие генерацию сигналов, перенос их к клеткам-мишеням, а также специфическое распознавание сигналов клетками, которым они адресованы.