Экспрессия генов Патрушев

162

инактивирующие сайты сплайсинга; + – взаимодействия, обеспечивающие распознавание экзонов; AAUAAA – поли(А)-сайт

определения экзонов у животных, взаимодействие между соседними сайтами сплайсинга в генах с короткими экзонами и длинными интронами происходит не через интроны, а через последовательности экзонов. Предполагается, что у пре-мРНК с длинными интронами система сплайсинга, прежде всего, отыскивает пару близкорасположенных сайтов сплайсинга, фланкирующих короткие последовательности экзонов (рис. I.16,а). После распознавания такой пары с ними взаимодействуют U1- и U2-мяРНП и ассоциированные факторы сплайсинга, включая факторы, распознающие 3’-концевые сайты сплайсинга – U2AF и SC35, а также фактор, узнающий 5’-концевой сайт сплайсинга – ASF/SF2. После завершения процесса определения экзона соседние экзоны входят в контакт друг с другом в результате взаимодействия между факторами, распознающими индивидуальные экзоны. Таким образом, в соответствии с этой моделью процесс сборки активной сплайсомы у позвоночных проходит в два этапа, включающие определение экзонов и их сближение между собой. В генах с небольшими интронами, например у низших эукариот, по-видимому, реализуется альтернативный механизм (см. рис. I.16,б). В этом случае первым этапом сборки сплайсомы является определение интрона.

В результате мутаций, связанных с нарушением сплайсинга, возникает, по крайней мере, четыре фенотипа: игнорирование экзона, который вырезается вместе с интронами; активация новых (криптических) сайтов сплайсинга; возникновение внутри интронов псевдоэкзонов, последовательности которых не вырезаются из пре-мРНК, и игнорирование интронов. Частоты этих мутаций составляют соответственно 51, 32, 11 и 6%. Все фенотипы, за исключением последнего, могут быть объяснены на основе обсуждаемой модели определения экзонов.

Эта же модель позволяет предсказывать максимальные и минимальные размеры экзонов в генах эукариот. Действительно, анализ длин 1600 внутренних экзонов показал, что только 3,5% из них содержат более 300 нуклеотидов и менее 1% – 400 нуклеотидов. Кроме того, доля экзонов, длина которых меньше 50 нуклеотидов, в этой выборке также незначительна. Известно, что в опытах in vitro сплайсинг резко ингибируется, если длина

163

внутренних экзонов превышает 400 нуклеотидов или становится меньше 50 нуклеотидов. Все эти факты делают модель определения экзонов весьма правдоподобной. Более короткие экзоны, длина которых составляет 6 или 7 п.о., часто обнаруживаемые в генах белков мышц, распознаются системой сплайсинга через энхансерные регуляторные последовательности, расположенные в интронах рядом с экзонами. Механизм распознавания очень длинных экзонов остается неизвестным.

2.2.4. Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов РНК-полимеразы II

РНК не может находиться in vivo в свободном виде. На протяжении всего внутриклеточного существования – от инициации биосинтеза до полной деградации – РНК пребывает в составе рибонуклеопротеиновых комплексов (РНП). Интенсивные исследования РНП-частиц выявили множество белков, образующих такие комплексы. Поскольку почти все мРНК эукариот претерпевают одни и те же внутриклеточные превращения, основными из которых являются кэпирование, полиаденилирование и сплайсинг, в составе РНП обнаруживают ограниченный набор белков, обеспечивающих протекание этих процессов. Помимо белков, необходимых для специфической трансляции мРНК определенных видов, а следовательно, и ассоциированных только с этими видами мРНК, два белка представлены почти во всех цитоплазматических мРНП животных в больших количествах – уже обсуждавшийся выше поли(А)-связывающий белок PABP и белок р50. Роль последнего как универсального регулятора трансляции обсуждается в разделе 3.4. Здесь же будут рассмотрены другие, не менее универсальные белки мРНП, которые взаимодействуют с кэп-группами и обеспечивают сопряжение основных реакций посттранскрипционных модификаций мРНК эукариот и экспорта мРНП из ядра в цитоплазму.

Ядерный кэп-связывающий комплекс (CBC). Присоединение кэп-

группы к любой строящейся цепи мРНК эукариот, что является ее первой (котранскрипционной) модификацией, оказывает глобальное влияние на все последующие реакции внутриклеточного метаболизма мРНК, включая ее трансляцию. Наличие кэп-группы дает возможность мРНК специфически взаимодействовать с белковым ядерным кэп-связывающим комплексом CBC

164

(cap-binding complex). Очищенный до гомогенности CBC представляет собой гетеродимер белков CBP80 (молекулярная масса 80 кДа) и CBP20 (20 кДа). N- Концевая часть большой субъединицы CBC содержит сигнал ядерной локализации NLS (nuclear localization signal), обеспечивающий челночные функции CBC во время экспорта мРНП из ядра в цитоплазму (см. ниже). Для взаимодействия CBC с кэп-группой мРНК требуются обе его субъединицы, которые по отдельности не обладают кэп-связывающими свойствами. Обсуждаемые функции CBC сохраняются у всех исследованных видов эукариот

– от дрожжей до человека.

Роль CBC в сплайсинге пре-мРНК. Уже более 15 лет известно, что кэпструктура m7G необходима для эффективного сплайсинга пре-мРНК в бесклеточных экстрактах клеток животных. Было установлено, что сплайсинг пре-мРНК с одним интроном подавляется в присутствии экзогенных аналогов кэпа или кэп-содержащих РНК. Резкое ингибирование сплайсинга наблюдали в экстрактах, истощенных с помощью специфических антител по большой субъединице CBC – CBP80. Дальнейшее всестороннее изучение этого явления показало, что гетеродимерный CBC требуется для эффективного сплайсинга кэпированных пре-мРНК.

Оказалось, что во время сплайсинга больших пре-мРНК кэп-группа оказывает влияние лишь на вырезание ближайшего к ней интрона. На рис. I.16в схематически представлены результаты опытов, особенно четко демонстрирующих данное явление. В этих экспериментах использовали искусственные кэпированные пре-мРНК с двумя интронами, которые содержали один или несколько мутантных канонических сайтов сплайсинга в разных комбинациях. Инактивация 5'-концевого сайта сплайсинга первого интрона не оказывала влияния на вырезание второго интрона и блокировала вырезание первого (см. рис. I.16,в,2). Мутация в ближайшем к кэп-группе 3'-концевом сайте сплайсинга сопровождалась вырезанием большой последовательности, включающей оба интрона и второй экзон, расположенный между ними (см. рис. I.16,в,3). Такая конструкция процессировалась как пре-мРНК, содержащая только один интрон, вырезание которого зависело от наличия комплекса CBC. В том случае, если были инактивированы как 3'-, так и 5'-концевой сайты сплайсинга первого интрона, вырезание второго интрона происходило независимо от CBC (в истощенных по комплексу экстрактах) (не отражено на

165

рисунке). Лишь одновременное разрушение 5'-концевого сайта сплайсинга и полипиримидиновой последовательности первого экзона сопровождалось появлением CBC-зависимости вырезания второго интрона (см. рис. I.16,в,4). (Полипиримидиновая последовательность обсуждалась выше, в начале подраздела, посвященного сплайсингу.) Полученные данные показывают, что именно полипиримидиновая последовательность, а не 5'-концевой сайт сплайсинга первого экзона, обеспечивает кэп-независимое вырезание второго интрона. Принимая во внимание, что CBC необходим для эффективного взаимодействия U1-мяРНП с 5'-концевым сайтом сплайсинга ближайшего к нему интрона, высказывают предположение, что полипиримидиновая последовательность, расположенная перед центральным экзоном, выполняет аналогичные функции при определении этого экзона системой сплайсинга.

Сопряжение сплайсинга с формированием 3'-концевых последовательностей пре-мРНК. Для предшественников мРНК, не содержащих кэп-групп, характерна малая эффективность процессинга их 3'- концевых последовательностей в экстрактах ядер. Кроме того, в таких бесклеточных системах расщепление кэпированной пре-мРНК вблизи поли(А)- сайта подавляется аналогом кэп-группы m7GpppG и не происходит в экстрактах, истощенных по CBC с помощью антител. На основании такого рода данных делается вывод, что во время процессинга пре-мРНК CBC пространственно сближен с комплексом белков системы, формирующей 3'-концевые последовательности, и стабилизирует этот комплекс через белок–белковые взаимодействия, что необходимо для его эффективного функционирования. Пространственное сближение 5'- и 3'-концевых последовательностей было прямо продемонстрировано для РНП гигантских (35–40 т.о.) транскриптов колец Бальбиани.

В соответствии с современной моделью, поли(А)-сайт пре-мРНК участвует в определении ее последнего интрона вместо обычно используемого для этой цели 5'-концевого сайта сплайсинга. Недавно было установлено, что, в свою очередь, и 3'-концевой сайт сплайсинга последнего интрона стимулирует полиаденилирование пре-мРНК, а следовательно, и процесс удаления последнего интрона сопряжен с полиаденилированием предшественника.

Участие CBC в экспорте транскриптов РНК-полимеразы II из ядер в цитоплазму. Транскрипты РНК-полимеразы II разделяют, по крайней мере, на

166

два больших класса: мРНК и U-мяРНК. Для РНК обоих классов характерно наличие кэп-групп, но малые ядерные РНК не полиаденилированы. Наличие кэп-группы резко стимулирует экспорт этих РНК из ядер в цитоплазму. С помощью иммуноэлектронной микроскопии удалось осуществить наблюдения in situ за динамикой ассоциации, экспорта, а также диссоциации субъединиц CBC и транскриптов колец Бальбиани, которые представляют собой гигантские пуффы на политенных хромосомах слюнных желез комара Chironomus tentans. Проведение прямых наблюдений стало возможным благодаря большому размеру транскриптов колец Бальбиани (35–40 т.п.о.) и, как следствие, их премРНП, в состав каждого из которых входит до 200 молекул белков. Было установлено, что белки CBC выходят из ядер в составе мРНП и повторно импортируются в ядра. При этом, в соответствии с современной моделью, происходит следующая последовательность реакций.

Как уже упоминалось, большая субъединица CBC CBP80 содержит специфическую аминокислотную последовательность – сигнал ядерной локализации (NLS). Гетеродимерный цитоплазматический рецептор этого сигнала животных состоит из двух субъединиц – импортина α (молекулярная масса 60 кДа) и импортина β (90 кДа). В цитоплазме импортин α взаимодействует непосредственно с NLS белков, импортируемых в ядро, и импортином β, который в, свою очередь, содержит сайт взаимодействия с ядерным поровым комплексом NPC (nuclear pore complex). Через NPC происходит обмен макромолекулами ядра и цитоплазмы. Белки, содержащие NLS, в комплексе с рецептором переносятся в ядро, где рецептор диссоциирует на субъединицы. Диссоциация рецептора на две субъединицы импортина в нуклеоплазме запускается особым ферментом, GTPазой Ran, связанной с GTP, сродство к которой импортина β выше, чем к импортину α. В результате импортин β удаляется из комплекса. В настоящее время не исключается возможность того, что диссоциировавшая субъединица импортина β остается связанной с цитоплазматической частью NPC. Механизм дальнейшей диссоциации импортина α и NLS не ясен. Полагают, что выход импортина β из комплекса ослабляет связь импортина α и NLS большинства ядерных белков, но не большой субъединицы CBC, с которой импортин α взаимодействует особенно прочно.

167

В ядре синтезированные РНК через кэп-группу взаимодействуют с CBC, находящимся в комплексе с импортином α, и через NPC перемещаются из ядра в цитоплазму. На цитоплазматической части NPC или в цитоплазме к комплексу CBC–РНК–импортин α присоединяется импортин β через импортин β- связывающий домен импортина α. Это облегчается тем, что в цитоплазме GTPаза Ran находится в комплексе с GDP из-за присутствия так называемого белка 1, активирующего GTPазу Ran (Ran GAP1), которая в его присутствии гидролизует связанный с ней GTP. Благодаря особым свойствам NLS кэпсвязывающего комплекса CBC, присоединение импортина β в данном случае сопровождается диссоциацией РНК и белкового комплекса CBC-рецептор. В таком виде белковый комплекс переносится в нуклеоплазму, и цикл экспорта синтезированной РНК начинается сначала. В случае U–гяРНП такая цитоплазматическая диссоциация комплекса приводит к гиперметилированию кэп-группы гяРНК, сборке нового комплекса и реимпорту его вместе с гяРНК в ядро. Освобождение кэп-группы мРНК после ее выхода из ядра в цитоплазму делает возможным взаимодействие с ней фактора инициации трансляции eIF4E с последующим вовлечением мРНК в синтез белка (см. раздел 2.5.1).

Участие CBC в сборке РНП-частиц и формировании правильной пространственной структуры мРНК. Большинство информации о сборке РНП-частиц и механизмах формирования пространственной структуры мРНК в цитоплазме получено с использованием транскриптов колец Бальбиани. Поэтому остается под сомнением возможность распространения выявленных закономерностей на другие транскрипты.

Сборка РНП-частиц осуществляется котранскрипционно (т.е. одновременно с транскрипцией) и начинается с 5'-конца растущей цепи РНК. Поскольку присоединение CBC к кэп-группе происходит одним из первых, полагают, что это инициирует упорядоченное взаимодействие с РНК других белков, входящих в состав гяРНП, с образованием РНП-фибриллы. Наличие кэп-группы дает возможность соответствующим механизмам функционально различать транскрипты РНК-полимераз I, II и III. Действительно, РНК, синтезируемые РНК-полимеразами I и III, не содержат на своих 5'-концах m7G- групп, включаются в РНП в составе других белков и не подвергаются сплайсингу и полиаденилированию. Для этих транскриптов характерны и другие механизмы транспорта из ядра в цитоплазму. Полагают, что набор белков,

168

ассоциированных с РНК разных классов, определяется, прежде всего, особенностями их первичной структуры. В то же время белки РНП обеспечивают РНК пространственную структуру, оптимальную для ее дальнейшего внутриклеточного метаболизма и функционирования.

2.3. Функциональная компартментализация ядра

При рассмотрении механизмов реализации генетической информации на уровне транскрипции и посттранскрипционных модификаций РНК чаще всего не принимается во внимание пространственная внутриклеточная организация макромолекулярных комплексов, обеспечивающих осуществление этих механизмов. Имеются, по крайней мере, две причины, по которым такого рода вопросам в современных исследованиях уделяется недостаточное внимание. Во-первых, большинство молекулярно-генетических исследований механизмов транскрипции проводится в бесклеточных системах, где вполне удовлетворительно выявляются отдельные компоненты функциональных макромолекулярных комплексов и их биохимические функции. Во-вторых, такие эксперименты сопряжены со значительными методическими сложностями и в настоящее время, как правило, ограничиваются различными приложениями микроскопии в сочетании с молекулярными зондами. Однако переход с фундаментального молекулярного уровня исследований в бесклеточных системах ("метаболического котла") на более высокий, учитывающий пространственную организацию биохимических процессов, неизбежен, так как именно на нем реализуются жизненно важные принципы интеграции и регуляции метаболизма живого организма во всех его проявлениях.

Концепция функциональной компартментализации эукариотической клетки в настоящее время общепринята и основывается на признании существования многочисленных внутриклеточных органелл, одной из которых является ядро. Наличие дискретных микрокомпартментов в отдельных органеллах менее очевидно, однако реально подтверждается в эксперименте. Результаты, полученные при использовании нескольких независимых подходов, указывают на компартментализацию процессов репликации, транскрипции и процессинга РНК в эукариотических ядрах. Так, синтез ДНК и РНК тонко организован во времени и пространстве. Интерфазные хромосомы занимают в ядрах вполне определенные микрокомпартменты (хромосомные

169

зоны или территории) и не перемешаны друг с другом. При этом их пространственная структура высокоупорядочена.

2.3.1.Интерфазные хромосомы в ядре

Вразделе 1.3 уже кратко обсуждался петельно-доменный уровень структурной организации хромосом эукариот, который отражает разделение интерфазных хромосом на дискретные домены по функциональному признаку. Наибольшее число экспериментальных данных в пользу наличия таких функциональных доменов было получено в исследованиях хромосом дрозофилы в связи с мозаичным эффектом положения, в которых использовались методы генетического анализа в сочетании с цитологическими наблюдениями политенных хромосом. Феномен эффекта положения и молекулярные механизмы, лежащие в его основе, будут более подробно рассмотрены в разделе 3.2.4. Говоря коротко, эффект положения заключается

втом, что перенос активно транскрибируемых генов к неактивным гетерохроматизированным участкам хромосом часто сопровождается значительным подавлением транскрипционной активности генов в их новом положении на хромосоме. Возможен поиск генов, ингибирующих или усиливающих эффект положения генов-репортеров, уровень экспрессии которых легко устанавливается фенотипически, например по изменению интенсивности окраски глаз. Многие из идентифицированных таким образом генов кодируют структурные компоненты хроматина или ферменты, ковалентно модифицирующие эти компоненты.

Эффект положения рассматривается в настоящее время в качестве универсального явления, характерного для всех эукариотических хромосом. Он наглядно демонстрирует наличие в интерфазных хромосомах высокоупорядоченной доменной структуры, тесно связанной с транскрипционной активностью соответствующих участков генома. Распределение участков хроматина с разным уровнем конденсированности в интерфазных хромосомах упорядочено и, по-видимому, является видовым признаком организма. Имеются указания на то, что структурные компоненты конденсированного хроматина оказывают влияние на пространственное расположение соответствующих частей хромосом в ядре. Следовательно, такая их микрокомпартментализация может играть важную роль в регуляции

170

экспрессии генов.

Уже в ранних цитологических экспериментах (С. Рабл, 1885 г.) было показано, что теломерные участки хромосом клеток слюнных желез саламандр располагаются вблизи ядерной оболочки. В настоящее время установлена локализация на периферии ядер теломер политенных хромосом дрозофилы, а также теломерных участков хромосом Schizosaccharomyces pombe в фазе G2 клеточного цикла. С помощью конфокальной иммунофлуоресцентной микроскопии продемонстрировано, что перинуклеарную локализацию теломер дрожжей S. cerevisiae обеспечивают, по крайней мере, два белка – Sir3 и Sir4 (silent information regulators), которые также требуются для наследуемой инактивации генов в специфических доменах хромосом, расположенных в локусе, определяющем тип спаривания у дрожжей, и вблизи теломерных последовательностей. В такого рода экспериментах была установлена связь между ядерной локализацией конкретных участков хромосом и их транскрипционной активностью.

В отличие от теломерных участков хромосом, активно экспрессирующиеся гены локализуются преимущественно во внутренних частях интерфазных ядер. При этом, по мнению Д.Б. Лоуренса и соавторов (1993 г.), отдельные гены внутри ядер располагаются упорядоченно. В частности, было установлено, что активно транскрибируемые гены вируса Эпштейна–Барр и онкогена neu находятся в разных местах внутренних 50% ядерного объема, а ген дистрофина – вблизи ядерной оболочки. В этой серии экспериментов три неактивных гена, кодирующих альбумин, тяжелую цепь сердечного миозина и нейротензин, локализовали в составе конститутивного гетерохроматина на периферии ядер или вблизи ядрышка. Используя микрооблучение ультрафиолетовым светом и гибридизацию с зондами, показали, что отдельные хромосомы занимают внутри ядра дискретные, хотя и обширные, территории. Компоненты аппарата сплайсинга обнаруживают в ядрах на периферии территорий, занимаемых индивидуальными хромосомами, так же как и треки синтезируемой РНК (см. ниже). В соответствии с моделью Т. Кремера (1993 г.), внутриядерное пространство между территориями, занимаемыми индивидуальными хромосомами, представляет собой единый компартмент, в котором происходят транскрипция, сплайсинг, созревание транскриптов и их транспорт. Этот компартмент тесно ассоциирован с активно