14.2.3. Оцінка субпопуляцій за рецепторами на поверхні клітин

Визначення лімфоцитів є непростою задачею із-за наявності багатьох субпопуляцій, які за морфологією звичайно розрізняються слабко або не розрізняються взагалі. Їх виявляють в основному в імунологічних реакціях, що дозволяють оцінювати функціональну активність клітин або ідентифікувати на їхній поверхні специфічні рецептори та антигенні маркери, характерні для даної субпопуляції, за допомогою відповідних моноклональних антитіл. У даний час моноклональні антитіла для визначення субпопуляцій клітин імунної системи людини виготовляють багато вітчизняних та закордонних фірм. Вченими було доведено, що присутність на поверхні клітин того чи іншого антигенного маркера в деякій мірі корелює з виконанням нею певної функції. Перелічимо диференційні антигени, по виявленню яких визначають найважливіші субпопуляції лімфоцитів.

Т-лімфоцити.Для ідентифікації Т-лімфоцитів людини на їхній поверхні за допомогою моноклональних антитіл виявляють молекули CD3 або CD2 (останній є рецептором до еритроцитів барана). Методи виявлення Т-клітин розрізняються в основному за способом виявлення факту зв’язування антитіл з даними диференційними антигенами на поверхні клітин.

Т-хелпери, крім згальних для всіх Т-лімфоцитів антигенів, несуть на своїй поверхні молекули CD4 і Fсμ-рецептор, по яких й ідентифікують ці клітини. Крім Т-хелперів, CD4 експресується частиною моноцитів і кортикальних тимоцитів. Диференційний антиген CD4 виявляють на клітинах за допомогою відповідних моноклональних антитіл методами, аналогічними ідентифікації Т-лімфоцитів.

Цитотоксичні Т-лімфоцити (Т-кілери) мають на своїй поверхні диференційний антиген CD8 і Fсγ-рецептор. Ці молекули виявляють на клітинах так само, як і інші поверхневі антигени — тобто за допомогою відповідних моноклональних антитіл. CD8 виявляється також на Т-супресорах, на деяких NK-клітинах і кортикальних тимоцитах, тому для детальної ідентифікації потрібно ставити тести на наявність інших специфічних маркерів.

В-лімфоцити визначають по експресії на їхній поверхні молекул CD19, CD20 і CD 21 (рецептор для C3d компонента комплементу, а таож для вірусу Епштейна-Бар). Усі ці молекули є також на частині попередників В-лімфоцитів. На юних В-клітинах присутні рецептори до еритроцитів миші. Методи виявлення диференційних антигенів на поверхні В-лімфоцитів такі ж, як і на Т-клітинах.

NK-лімфоцити в основному не несуть маркерів, характерних для Т- або В-лімфоцитів (хоча частина цих клітин може мати на своїй поверхні CD2, фрагменти CD3 і CD8 молекул). Специфічними маркерами NK-клітин є CD16, CD56 і CD57 антигени. Їх виявляють на поверхні цих клітин за допомогою відповідних моноклональних антитіл тими ж способами, що й інші диференційні молекули. NK-клітини морфологічно відрізняються від лімфоцитів інших типів – це великі клітини із великою кількістю азурофільних гранул всередині (так звані великі гранулярні лімфоцити).

Fas-рецептори (CD95 антигени) з’являються на клітинах, активованих до апоптозу. Присутні на різних клітинах. Виявляють їх за допомогою відповідних моноклональних антитіл тими ж методами, що й інші диференційні антигени.

Слід відмітити, що виконання клітинами тої чи іншої функції залежить не тільки від наявності певних антигенних маркерів і рецепторів, але й в значній мірі від гуморального і клітинного мікрооточення клітини. Так, наприклад, хелперна функція може не тільки зникати, але навіть частково замінятися на іншу. Наявність однакового рецептора у Т-кілерів (цитотоксичних лімфоцитів) і Т-супресорів теж може свідчити про можливість зміни функцій клітини у ході її дозрівання в певних умовах оточення. Тобто та чи інша функція клітини може бути лише переважною. Крім того, лімфоцити можуть знаходитись у різному фізіологічному стані і розрізнятися швідкістю ділення, рівнем біосинтеза цитокінів та інших сполук, що відібражається експресією тих чи інших молекул на поверхню клітини. Наприклад, здатністю синтезувати більшість цитокінів володіють тільки активовані клітини. У зв’язку з усім переліченим популяція лімфоцитів дуже гетерогенна. Слід враховувати також, що функції клітин in vivo та in vitro теж можуть істотно розрізнятися.

Для контролю зв’язування моноклональних антитіл з відповідними маркерними антигенами лімфоцитів в діагностичній практиці найбільш часто застосовують такі методи:

1. люмінісцентно-серологічний метод;

2. метод проточної цитофлуорометрії;

3. візуальний стрептавідін-біотіновий метод;

4. метод імуномагнітної сепарації клітин;

5. метод специфічного цитолізу лімфоцитів;

6. метод розеткоутворення.

Більшість реакцій (методи имунофлюоресценції, розеткоутворення, хемілюмінісценції та ін.) можна ставити з використанням як суспензій очищених клітинних популяцій, так і суспензій нерозділених лімфоцитів.

Далі будуть розглянуті перелічені методи виявлення субпопуляцій лімфоцитів по рецепторах на їхній поверхні.