14.2.1 Кількісна оцінка типів лейкоцитів крові

При первинному обстеженні хворого роблять аналіз крові з визначенням основних популяцій лейкоцитів, тобто складають лейкограму, яка може надати лікареві інформацію про загальний стан імунної системи і наявність запалення.

Визначення вмісту в крові лейкоцитів і кількісна оцінка основних їх типів (формула крові, або лейкограма) здійснюються в практичній медицині з 30-х років ХХ сторіччя, коли В.Шилінгом були описані прості методи визначення цих показників із застосуванням мікроскопічного дослідження. Визначення лейкоцитів різних типів базується на розходження в їхньому фарбуванні основними і кислими аніліновими барвниками, а також на виявленні морфологічних відмінностей. Для ідентифікації лейкоцитів підбирають варіанти фарбування, прилади для розпізнавання клітин (мікроскоп, цитометр або інші). В Україні найбільш розповсюджений спосіб візуального визначення клітин за допомогою мікроскопа. Сумарний вміст лейкоцитів у крові визначають шляхом підрахунку кількості клітин у певному об’ємі крові, розведеної 20-кратним об’ємом 3%-ного водного розчину оцтової кислоти, що руйнує еритроцити. Підрахунок клітин ведеться за допомогою камери Горяєва у мазку, який готують із краплі крові на предметному склі і після фіксації фарбують сумішами азура і еозина. Фарбування проводять ретельно, щоб можна було чітко виявити основні клітинні структури (ядро, цитоплазму, гранули). При мікроскопіюванні клітини різних популяцій лейкоцитів – базофіли, нейтрофіли, еозинофіли, моноцити, макрофаги – добре розрізняються. Морфологічні та функціональні особливості лейкоцитів детально описані в Розділі 5.

В останні роки розповсюджуються високопродуктивні автоматичні прилади, які визначають популяції клітин у пофарбованому мазку шляхом порівняння морфології досліджуваних клітин з образами клітин різних типів, що зберігаються у пам’яті комп’ютера, або здійснюється ідентифікація клітин у цільній крові за їх розміром та цитохімічними властивостями. Подібні аналізатори мають високу процесивність і точність, що дозволяє визначати тисячі клітин (при мікроскопіюванні – 100-200), а також виявляти ті клітини, вміст яких у крові невеликий – еозінофили, базофіли, плазматичні клітини. Однак патологічні клітини (і особливо пухлинні), які мають змінені ядра та інші органели, потребують “ручної” перевірки і розпізнавання. Для цього в лабораторії повинні бути кваліфіковані кадри.

Оскільки лейкоцити виділяють із крові, лейкограму доцільно доповнювати показниками, що оцінюють властивості цільної крові. Одним з таких показників є швидкість осідання еритроцитів (ШОЕ), що відібражає реологічні властивості плазми. Для визначення ШОЕ кров перемішують з антикоагулянтом (цитратом натрію), наливають у мірний капіляр, витримують протягом години і вимірюють у міліметрах висоту стовпчика плазми над осілим осадом клітин.

14.2.2. Одержання цільної суспензії лейкоцитів та їх субпопуляцій

Виділення цільної суспензії лейкоцитів перш за все передбачає відділення їх від еритроцитів. Для цього використовують різноманітні методи.

Метод спонтанного осадження еритроцитів заснований на розходженні питомої маси еритроцитів (1,097 кг/л) і лейкоцитів (1,07-1,08 кг/л). Він полягає в тому, що кров витримують при 20-37°С на протязі 0,5-1,5 год., в результаті чого вона розшаровується: нижній шар містить переважно еритроцити (з домішкою лейкоцитів), верхній – плазму, збагачену лейкоцитами. Плазму відбирають і лейкоцити осаджують центрифугуванням. Для поліпшення відділення лейкоцитів від еритроцитів до крові додають речовини, що утворюють колоїдні розчини (декстран, желатин, фібриноген, та ін.). Наприклад, 3%-ний розчин желатину у фізіологічному розчині змішують із кров’ю у співвідношенні 1:3, після чого інкубують при 37°С на протязі 30-40 хв, відбирають надосадову рідину і з неї лейкоцити осаджують центрифугуванням.

Цей метод найбільш простий і дозволяє виділяти лейкоцити крові з мінімальним ушкодженням при збереженні співвідношення субпопуляцій лімфоцитів практично як у цільній крові. Однак, у виділеній суспензії лейкоцитів практично завжди присутні еритроцити.

Друга група методів заснована на видаленні еритроцитів з цільної крові шляхом їхнього гемолізу гіпотонічними розчинами. Оскільки вміст еритроцитів у цільній крові великий, лізис ведуть з використанням великого надлишку розчинів. Для гемолізу звичайно беруть або дистильовану воду, або розчин 0,83%-хлористого амонію, рідше – суміш оцтової і виннокам’яної кислот, сапонін, граміцидін, лизолецитін, гемолітичні сироватки, стрептолізин та ін.

Гемоліз дистильованою водою ведуть шляхом додавання у кров 40-50-кратного об‘єму дистильованої води. Суміш перемішують 35-40 секунд, після чого відновлюють осмотичний тиск, доливаючи відповідну кількість 10-кратного концентрату фізіологічного розчину. Цілі лейкоцити осаджують центрифугуванням.

Гемоліз розчином хлористого амонію. До крові додають 8-10-кратний обсяг 0,83%-ного розчину хлористого амонію (рН 7,4), перемішують протягом 2-3 хв. Потім доливають стільки ж розчину Хенкса. Клітини осаджують центрифугуванням.

Слід відмітити, що гемоліз дистильованою водою є більш м’яким, оскільки припускає менш тривалий вплив на клітини і практично миттєве і повне зняття цього впливу, що досягається додатком 10-кратного концентрату фізіологічного розчину. Це підтверджують дані про життєздатність клітин, близької до 100%, і повного зберігання фагоцитарної активності нейтрофілів. При використанні розчину хлористого амонію вплив речовини на клітини не знімається фактично до закінчення їхнього відмивання. У порівнянні з лімфоцитами гранулоцити менш стійкі до впливу іонів амонію і хлору, із-за чого після гемолізу здатність нейтрофілів до фагоцитозу різко зменшується аж до повної утрати.

Спосіб одержання лейкоцитів шляхом гемолізу еритроцитів дозволяє одержувати всі лейкоцити, що є у крові, практично без утрат.

Отримання окремих популяцій лейкоцитів здійснюють з використанням градієнта щільності, який створюють за допомогою водного розчину фікола з домішкою гіпака, ізопака, верографіна, або інших речовин. Фракціонування лейкоцитів здійснюють таким чином: 6-12 мл крові (розведеної фізіологічним розчином у 2-3 рази) наносять на поверхню градієнтного розчину – суміш гіпак-фіколла (10 частин 34%-ного гіпака і 24 частини 8-9 %-ного розчину фіколла в дистильованій воді). Здійснюють центрифугування суміші при 400g протягом 30-40 хв. У результаті клітини крові розділяються на декілька шарів: моноядерні клітини і тромбоцити знаходяться між плазмою і градієнтом (інтерфазний шар), у той час як гранулоцити й еритроцити осідають на дно пробірки. Інтерфазный шар збирають і після триразового відмивання одержують суспензію моноядерних клітин. При цьому вихід лімфоцитів складає 60-75%. Гранулоцити, що осіли на дно пробірки разом з еритроцитами, виділяють так само, як лейкоцити з цільної крові – седиментацією у присутності желатину або декстрану. Таким чином, використання градієнтів дозволяє розділяти суцільну суспензію лейкоцитів на окремі популяції: моноядерні клітини і гранулоцити.

Слід зауважити, що градієнтне центрифугування має певні недоліки, оскільки змінює склад моноядерних клітин за рахунок селективного збагачення одних і втрати інших популяцій або субпопуляцій із-за тривалого контакту з градієнтом. Так, частина Т-лімфоцитів може осідати на дно через утворення аутологічних розеток, фікол може змінювати фізіологічну активність клітин.

Необхідно також мати на увазі, що високоочищені клітини однієї популяції (наприклад, лімфоцити) значно слабкіше реагують на різні впливи і менш активні при постановці функціональних імунологічних тестів, чим ті, котрі мають домішки клітин інших популяцій. Це може бути пов’язане з наявністю кооперативного ефекту дії клітин в імунологічних реакціях.