14.3.2. Визначення цитотоксичної активності лімфоцитів

Даний метод призначений для оцінки кілерної активності великих гранулярних лімфоцитів, в основному природних кілерів (NK-клітин) і К-клітин, здатних реалізувати антитілозалежну клітинну цитотоксичность (АЗКЦТ). Перелічені клітини не тільки in vivo, а й in vitro здатні руйнувати клітини-мішені, на поверхні яких експресовані чужорідні, або змінені власні антигени (див. розд. 6, Реакції кілингу). При постанові реакції лімфоцити, очищені від моноцитів і гранулоцитів (також викликають лізис клітин-мішеней) инкубують із кліткинами-мішенями. Цитотоксичний ефект визначають у декілька способів: 1) підраховуючи кількість живих клітин-мішеней, що залишилися; 2) оцінюючи морфологічні зміни клітин-мішеней; 3) по появі радіоактивного ізотопу 51Сг, який викидується у культуральне середовище при руйнуванні клітин-мішеней. Звичайно беруть кілька проб з різними співвідношеннями лімфоцитів і клітин-мішеней.

При визначенні К-клітин по реакції АЗКЦТ як клітини-мішені звичайно використовують еритроцити тварин або інші клітини (наприклад, клітини мастоцитоми мишей, резистентні до лізису моноцитами і гранулоцитами). Оскільки кілинг у даному випадку здійснюється у присутності антитіл, завчасно проводять сенсибілізацію еритроцитів антиеритроцитарними антитілами, міченими ⁵¹Сг. Для цього проводять інкубацію з розчином Nа₂⁵¹СrO₄ або Nа₂⁵¹Сr₂O₇. Лімфоцити инкубують із сенсибілізованими клітинами-мішенями протягом 2-24 години. В результаті лізису клітин-мішеней у середовище виділяється радіоактивний хром, кількість якого пропорційна рівневі цитотоксичності лімфоцитів.

Визначення активності природних кілерів (NK-клітин) здійснюють при використанні в якості клітин-мішеней пухлинних клітин, культивованих in vitro (наприклад, мієлоідну лінію К-562, лінії Р-4788, М-Hela та ін.). Клітини-мішені мітять солями радіоактивного ізотопу ⁵¹Сr. Лімфоцити инкубують із клітинами-мішенями протягом 3-24 ч. Активність NK-клітин оцінюють по виділенню у культуральне середовище радіоактивного ізотопу. Дані методи вимагають складної апаратури й умов роботи з ізотопами, тому застосовуються переважно в спеціалізованих лабораторіях.

14.3.3. Фагоцитарна активність нейтрофілів

Фагоцитарна активність нейтрофілів оцінюєтьсяза інтенсивністюпоглинання нейтрофілами чужорідного матеріалу. Для цього суспензію лейкоцитів змішують з чужорідними частками, инкубують 30 хв. при 37⁰С або центрифугують суміш при 200g 5 хв., після чого клітини фіксують і фарбують. Підраховують у світловому мікроскопі відсоток нейтрофілів, що захопили 1 або більш часток. Можна визначити середню кількістьчасток, захоплених одним нейтрофілом.

Як чужорідні частки при постанові фагоцитоза використовують бактерії (стафілокок, кишкову паличку та ін.), дріжджі (Sacharomyces cerevisiae, Candida albicans), частки зимозану або латексу. Використання живих біологічних культур приводить до нестабільних результатів, тому для великої кількості дослідів застосовують фіксовані мікробні клітини.

Для запобігання прилипання мікробних часток до поверхні нейтрофілів, що ускладнює урахування результатів при мікроскопіюванні, нейтрофіли обробляють трипсином для видалення з їх поверхні рецепторів і прилиплих часток. Для стандартизації результатів останнім часом найчастіше використовують частки латексу (розміром 1,5-2 мкм) або фіксовані клітини дріжджів, розмір яких звичайно 5-8 мкм. Фагоцитування нейтрофілами фіксованих дріжджових клітин спостерігати найбільш зручно: при захопленні цих часток сегменти ядра нейтрофіла розсовуються, клітина збільшується у розмірі, а частки, що прилипли до нейтрофілу, утворюють розетку.

Для оцінки імунного статусу і постанові імунограми показник фагоцитарної активністі нейтрофілів є дуже важливим, але нажаль і досі нема готових тест-систем для проведення реакції фагоцитозу, що ускладнює отримання відтворюваних результатів.