14.2.9. Методи розеткоутворення

Феномен спонтанного утворення розеток між лімфоцитами та еритроцитами різних тварин був вперше описаний А. Заальбергом у 1970 р. З того часу метод розеткоутворення отримав велике поширення у клінічній практиці і, не дивлячись на появу більш сучасних методів, він і тепер не втратив свого значення для препаративного виділення і кількісної оцінки субпопуляцій лімфоцитів.

Метод заснований на феномені спонтанного прилипання до поверхні лімфоцитів різних корпускулярних часток (в тому числі еритроцитів різних тварин) з утворенням розеток. Акт прилипання здійснюється за рахунок комплементарних структур (рецептор – ліганд) або завдяки неспецифічним силам адгезії.

Своєю точністю метод розеткоутворення поступаться методам з використанням моноклональних антитіл, але при значних порушеннях показників імунітету його інформативність є достатньо високою. При оцінці субпопуляцій лімфоцитів (Т-хелперів, Т-кілерів, Т-супресорів) слід враховувати рівень функціональної активності клітин, тому метод розеткоутворення можна використовувати для виявлення перших ознак імунної недостатності. Але за допомогою навантажувальних тестів можна визначати і зміни взаємозв’язків між клітинами імунної системи. Простота і низька вартість методу робить його досить цінним для невеликих клінічних лабораторій.

Тести розеткоутворення з еритроцитами тварин (Е-РУК та М-РУК) базуються на наявності на поверхні лімфоцитів рецепторів, зв’язуючих еритроцити. Завдяки цим тестам можна підрахувати кількість розеткоутворюючих клітин (РУК) тої чи іншої популяції лімфоцитів.

Метод Е-РУК – тест спонтанного розеткоутворення з еритроцитами барана – застосовують для виявлення Т-лімфоцитів людини. На їхній поверхні у великій кількості експресовані CD2 молекули, які й є рецепторами до еритроцитів барана. Розетки, що утворилися при зв’язуванні Т-лімфоцитів з еритроцитами барана, можна відділити від В-клітин у градієнті щільності фікола. Слід ураховувати, що CD2 присутні також у частини NK-клітин.

Метод М-РУК дозволяє виявляти В-лімфоцити завдяки їхній здатності утворювати спонтанні розетки з еритроцитами миші. Рецептори до еритроцитів миші у великій кількості присутні на менш зрілих В-клітинах.

В-лімфоцити можна виявляти також по наявності інших рецепторів за допомогою методів визначення ЕА-РУК і ЕАК-РУК. Для цього використовують антиеритроцитарні антитіла (відповідно IgG i IgM), отримані при імунізації кролів еритроцитами бика.

Метод ЕА-РУК використовують для визначення на В-лімфоцитах рецептора для Fc-фрагмента імуноглобулінів. Для постановки теста використовують суспензію лімфоцитів і комплекс ЕА, який включає чужерідні (ксеногенні) еритроцити, зв’язані з антиеритроцитарними антитілами. Fc-фрагменти останніх можуть приєднуватись до відповідних рецепторів В-лімфоцитів. В результаті цього утворюється більш складна розетка, в центрі якої розташований В-лімфоцит, а навколо нього – еритроцити, причому молекули імуноглобулінів виступають у ролі проміжних містків між В-лімфоцитами та еритроцитами.

Метод ЕАК-РУК дозволяє виявляти В-лімфоцити по їх рецепторам до С3-компонента комплемента. Для цього до суспензії лімфоцитів додають систему ЕАК (еритроцити + антиеритроцитарні IgM + комплемент). За рахунок зв’язування комплемента з С3-рецепторами весь комплекс приєднується до В-лімфоцита.

Результати реакцій Е-РУК, М-РУК, ЕА-РУК та ЕАК-РУК оцінюють по наявності розеток при мікроскопіюванні у світловому мікроскопі необроблених або пофарбованих препаратів. Роботу проводять з чистою популяцією лімфоцитів, виділених у градієнті щільності сахарози, суміші фікол-ізопак, перкола тощо.

Методи розеткоутворення з інертними ерітроцитами або штучними частками (наприклад, латексу, поліакріламідного гелю), покритими моноклональними антитілами, можна використовувати для визначення найрізноманітніших субпопуляцій имунокомпетентних клітин.