14.1.1. Реакція аглютинації

Аглютинація (від лат. agglutinatio – зклеювання) – феномен зклеювання корпускулярних антигенів (мікробних та тваринних клітин, часток латекса та ін.) специфічними антитілами сироватки з утворенням агрегата – аглютината, який випадає в осад. Аглютинат можна побачити неозброєним оком. Здатність зклеювати, тобто аглютинувати корпускулярні антигени проявляють в основному IgM та IgG. В цій реакції антигени позначають як аглютиногени, а антитіла - як аглютинини. При неспецифічному осадженні корпускулярних антигенів утворюється щільний осад (пуговка), який при взбовтуванні дає рівномірне помутніння. Специфічний аглютинат – крихкий, у вигляді сітки, при взбовтуванні рідина залишається прозорою, а в ній виявляються хлоп’я.

Для діагностики інфекційних хвороб реакція аглютинації застосовується у двох напрямках: 1) для виявлення специфічних антитіл у сироватках хворих за допомогою стандартних мікробних діагностикумів; 2) для ідентифікації збудника хвороби за допомогою діагностичних сироваток.

Реакція аглютинації “in vitro” потребує обов’язкового додавання електроліта (наприклад, фізіологічного розчина), тобто в ній приймають участь 3 компоненти: антиген, антитіло, електроліт. В реакції можна виділити дві стадії: на першій відбувається зв’язування антигенної детермінанти антигена з активним центром антитіла, тобто, з’єднання епітопа з паратопом; на другій – утворення аглютината у присутності електроліта, який знижує електричний заряд комплексів “антиген – антитіло” і прискорює їх зклеювання з утворенням аглютината.

Реакцію аглютинації ставлять у пробірках, на скляних чи картонних пластинках або у лунках полістеролових пластин. Для первинної ідентифікації збудника спочатку застосовують прискорений метод – пробну аглютинацію на склі з використанням високих концентрацій антигенів і антитіл. Така якісна реакція за декілька хвилин дозволяє встановити приналежність збудника до певного виду чи роду. Далі ставиться кількісна реакція у пробірках – розгорнута аглютинація – з різними розведеннями сироватки і однаковою концентрацією антигена, яка дозволяє визначити титр аглютинуючих антитіл – ту найменшу кількість антитіл, що здатна утворити аглютинат.

Розгорнута реакція аглютинації ставиться у такий спосіб: завчасно роблять ряд десятикратних роведень сироватки, використовуючи фізіологічний розчин (0,85% NaCl), потім у пробірки вносять по 0,5 мл сироватки у зростаючих розведеннях і по 0,5 мл стандартного діагностикума або суспензії досліджуваної культури з концентрацією клітин 1 млрд на 1 мл. Проводять інкубацію суміші при 37⁰С. Обов’язково ставлять контроль сироватки і антигена для запобігання отримання ложнопозитивних результатів із-за спонтанної аглютинації антигена або сироватки. Результат реакції аналізують спочатку через 2 год. і додатково через 20-24 год.. Оцінювання ведуть за чотирьоххрестною системою. При урахуванні результатів реакції визначають специфічність взаємодії антигена і антитіла, титр сироватки, характер аглютината. Останній залежить від природи антигена. Крупнохлопчастий осад дають джгутикові Н-антигени бактерій досить швидко, за 1-2 год. (Н-аглютинація); дрібнозернистий аглютинат утворюється повільно (20-24 год.) при взаємодії антитіл з соматичними О-антигенами бактерій (О-аглютинація); капсульні К-антигени дають тяжистий аглютинат (К-аглютинація). Аглютинацію еритроцитів регіструють по утворенню характерного зсідання клітин у вигляді зонтика. При відсутності аглютинації еритроцити осідають у вигляді пуговки. Надосадкова рідина при формуванні чіткого аглютината повинна бути прозорою.

Слід відмітити, що змінення титрів антитіл у сироватках хворого в динаміці інфекційного процесу може вказувати на ту чи іншу фазу розвитку інфекції і має діагностичне значення. Коли аглютинацію застосовують для серологічної ідентифікації збудника, реакція оцінюється як позитивна при розведенні діагностичної сироватки не менш половини її титра.

На практиці використовують декілька варіантів аглютинації: реакції прямої і непрямої аглютинації, реакцію гальмування гемаглютинації та ін..

Пряма аглютигація проводиться для безпосереднього виявленнякорпускулярнихмікробних антигенів або антигенів еритроцитів, що визначають їх приналежність до груп крові, або для виявлення відповідних антитіл у сироватках. Типовим прикладом прямої реакції аглютинації є реакція Відаля, яка дозволяє проводити дифереціальну діагностику кишкових інфекцій, а саме у досліджуваних сироватках за допомогою діагностикумів виявляються антитіла до одного зі збудників: Salmonella typhi, S. paratyphi A або S. paratyphi B. У перші дні хвороби, коли антитіла у сироватці ще не з’явились, можна виявити цих збудників при висіві із випражнень хворого і наступної їх ідентифікації за допомогою діагностичних специфічних сироваток.

Пряма аглютинація застосовується для серологічної видової ідентифікації сальмонел, шигел, ешеріхій та ін. бактерій. Для цього використовуютьполівалентні та моновалентні сироватки(поліспецифічні та моноспецифічні). Звичайно спочатку проводиться аглютинація з полівалентними сироватками, які містять декілька видів антитіл специфічних до антигенів даного роду чи виду бактерій. Потім ставиться розгорнута аглютинація у пробірках з моновалентними сироватками, яка дозволяє визначити не тільки вид, а й серотип (синонім “серовар” – серологічний варіант) збудника.

Адсорбція антитіл за методом Кастелані. Реакція прямої аглютинації використовується також для очистки неадсорбованих полівалентних сироваток і отримання на їх основі адсорбованих моновалентних (моноспецифічних, монорецепторних), бівалентних та ін.. Таку очистку здійснюють шляхом послідовного додавання антигенів для зв’язування і виведення в осад “непотрібних” антитіл.

Непряма аглютинація (пасивна аглютинація) – модифікація прямої аглютинації, яка дозволяє виявляти некорпускулярні розчинні антигени, адсорбовані на корпускулярних носіях. Як носії для таких антигенів застосовують імунологічно інертні частки латекса, бентоніта, оксид барія, еритроцити людини або ссавців, клітини стафілококів (реакція коаглютинації) тощо. Але найбільше розповсюдження набули реакції з використанням еритроцитів. Для покращення сорбції еритроцити обробляють таніном, формаліном або бензидином. Еритроцити з адсорбованими на них антигенами називають сенсибілізованими, а реакція, в якій вони беруть участь, має назву реакції непрямої або пасивної гемаглютинації (РНГА або РПГА). Сама назва реакції підкреслює, що еритроцити виконують в ній лише пасивну роль.

РНГА ставиться у лунках спеціальних полістиролових пластинок (планшеток) таким чином: прямо у лунках роблять двократні розведення сироваток і до них додають еритроцитарний діагностикум. Після 2 год. інкубації при 37⁰С оцінюють результат. Якщо антиген на поверхні еритроцита зв’язується із специфічними антитілами сироватки, то еритроцити випадають в осад з утворенням перегорнутого “зонтика”, тобто рівномірно покриваючи дно лунки (позитивна реакція). У протилежному випадку еритроцити зсідаються у центрі лунки, утворюючи так звану “пуговку” (негативна реакція).

Так само, як і пряма аглютинація, РНГА використовується у двох напрямках – для виявлення антитіл і антигенів. Для виявлення у сироватках хворих специфічних антитіл за допомогою РНГА використовують спеціальні еритроцитарні діагностикуми – сенсибілізовані певним антигеном еритроцити. У протилежному напрямку – для виявлення розчинних антигенів – використовують антитільні еритроцитарні діагностикуми – препарати еритроцитів з адсорбованими на них антитілами.

РНГА застосовують для серодіагностики черевного тифу (за допомогою Vi-еритроцитарного діагностикума), дизентерії, чуми, стафілокока (виявлення ентеротоксинів), токсоплазмоза, а також аутоантитіл.

Реакція непрямої аглютинації є більш чутливою у порівнянні з прямою і дозволяє виявляти антигени та антитіла у мінімальній кількості.

Реакція гальмування гемаглютинації (РГГА) використовується для встановлення видової та типової належності вірусів, зокрема вірусів грипу. В основу реакції покладена здатність вірусів адсорбуватися на еритроцитах і викликати їх неспецифічну аглютинацію. Гемаглютинуюча активність вірусів може бути пригнічена специфічними антитілами, які нейтралізують віруси. Для виявлення серотипу віруса, виділеного від хворого, використовують специфічні діагностичні протигрипозні сироватки А1, А2 і В. Реакція здійснюється у лунках плексиглазових пластинок. У лунки вносять проби сироваток по 0,25 мл у наростаючих розведеннях і потім додають по 0,25 мл рідини, що містить віруси у робочому розведенні. Робоче розведення досліджуваного віруса визначається передчасно в реакції гемаглютинації. Суміш у лунках взбовтують та інкубують при кімнатній температурі протягом 1-2 год., після чого у всі лунки додають по 0,5 мл суспезії еритроцитів півня. Через 1-2 год аналізують результати реакції. В тих рядах, де діагностичні сироватки не специфічні до віруса, буде спостерігатися гемаглютинація у вигляді зонтиків. І навпроти, якщо антитіла діагностичної сироватки будуть зв’язувати і нейтралізувати віруси, гемаглютинація буде пригнічуватись і еритроцити будуть зсідатися у вигляді пуговок. Типова приналежність віруса грипа визначається по тій специфічній сироватці, яка виявила пригнічення гемаглютинації у найвищих титрах.

Латекс-аглютинація (ЛАГ) – один з варіантів непрямої аглютинації, яка використовується як експрес-метод для швидкого виявлення антигенів мікроорганізмів у клінічному матеріалі. У даній реакції як носій антигенів використовуються частки латекса з різним діаметром. Реакцію виконують на склі мікрометодом: до 50 мкл досліджуваного матеріала додають 10 мкл латекс-препарата, сенсибілізованого антитілами. У комерційні латекс-препарати входять три стандартних зразка (контрольні тести): зразок з позитивною реакцією, зразок з негативною реакцією та зразок несенсибілізованого латекса з антигенним матеріалом.

Реакція коаглютинації – є різновидом пасивної аглютинації. В ній як носій використовують клітини золотистого стафілокока, чий поверхневий А-білок може зв’язуватись з Fс-фрагментами IgM та IgG. Реакцію проводять на склі у такий спосіб: до краплини 2% суспензії сенсибілізованих антитілами стафілококів додають суспензію досліджуваних бактерій. При відповідності антигена антитілам (адсорбованих на стафілококах), через 30-60 сек. Відбувається чітка аглютинація.

Реакція агрегат-гемаглютинації (РАГА) дозволяє за допомогою еритроцитарних діагностикумів виявляти не тільки антигени, а й циркулюючі імунні комплекси (ЦИК) - комплекси “антиген – антитіло”. При додаванні до сенсибілізованих еритроцитів сироватки хворого, яка містить антигени і антитіла до них, відбувається гемаглютинація із залучанням імунних комплексів.

Проба Кумбса – різновид реакції аглютинації для виявлення неповних блокуючих антитіл – Ig з одним активним центром. Може виконуватись як пряма, так і як пасивна аглютинація. Неповні антитіла з’єднуються з антигеном, але не здатні утворювати з ним великі агрегати, із-за чого реакція не візуалізується. Тому для виявлення специфічного зв’язування антигена з антитілом використовують антиглобулінову сироватку, яка містить імуноглобуліни проти неповних антитіл. Реакцію здійснюють у 2 етапи: 1) інкубують досліджувану сироватку (неповні антитіла) з відповідним діагностикумом – антигеном, реакція не візуалізується; 2) до інкубаційної суміші додають антиглобулінову сироватку, антитіла якої зв’язуються з Fc-фрагментами неповних антитіл, вже утворивших комплекси з антигеном. При специфічній відповідності неповних антитіл антигенам (позитивна реакція) на другому етапі виявляється аглютинація.

Пробу Кумбса використовують у діагностиці бруцельоза, аутоімунних та алергічних захворюваннях, при аналізі груп крові.

Імуномагнітне виявлення антигенів – прискорений метод непрямої реакції аглютинації на склі. У даному випадку антитіла зшивають з полімерними супермагнітними частками. Кожна з таких часток може зв’язати 10⁷ - 10⁸ клітин мікроорганізмів, завдяки чому швидко відбувається аглютинація з утворенням чіткого аглютината.