14.2.6. Візуальний стрептавідин-біотиновий метод

Датською компанією DAKO, а потім і багатьма іншими фірмами налагоджений випуск комплекту реагентів для фенотипіювання лімфоцитів за допомогою візуального стрептавідин-біотинового методу (технологія LSAB). Даний метод, не вимагаює складного лабораторного устаткування і має високу чутливість, дає можливість у мазках крові з пальця фарбувати клітини різних субпопуляцій лімфоцитів і спостерігати їх у світловому мікроскопі.

Візуальний стрептавідин-біотиновий метод за своєю специфічностю і чутливістю не поступається методу проточної цитофлуориметрії, але на відміну від останнього відрізняється більшою економічністю, оскільки не потребує дорогого устаткування.

Цей метод принципово відрізняється від люмінісцентно-серологічно тільки тим, що антитіла до антигенних маркерів клітин кон’югуються не з флюорохромом, а з ферментною міткою. В останні 10-15 років цей метод використовується для виявлення різних патологічних структур і клітин у гістоцитохімічних дослідженнях. Висока чутливість метода дозволяє застосовувати його для диференціальної діагностики пухлин, імунофенотипіювання пухлин (особливо лімфоїдних), ідентифікації різних мікроорганізмів у тканинах, визначення гормонів та їхніх рецепторів тощо.

Широке розповсюдження цього методу пов’язане з тим, що готові тест-системи для цього методу були розроблені багатьма відомими фірмами.

14.2.7. Метод імуномагнітної сепарації клітин

Норвезька фірма Dynal розробила метод виділення окремих типів живих клітин крові на основі застосування парамагнітних полістирольних мікрочасток, покритих моноклональмими антитілами до тих чи інших антигенних маркерів клітин. Такі мікрочастки додають у суспензію клітин і після інкубації (10 хвилин) пробірку ставлять у магнітний сепаратор. Клітини, що зв’язалися з частками, уловлюють, а супернатант видаляють. Відібрані клітини ресуспендують у буфері та їхню кількість підраховують у світловому мікроскопі.

Даний метод дає можливість проводити повне фенотипіювання всіх субпопуляцій лімфоцитів, виділяючи їх прямо з цільної крові, і крім того, відділяти їх від інших клітин з подібними рецепторами. Наприклад, при визначенні лімфоцитів CD4+ і CD8+ (хелперів і супресорів) вона дозволяє уникнути помилки в результатах аналізу за рахунок видалення інших CD4+ і CD8+ клітин (моноцитів і натуральних кілерів) шляхом попереднього виснаження суспензії клітин парамагнітними частками, специфічними до цих популяцій. На сьогоднішній день фірма розробила повний комплект тест-системи з протоколом дослідження для виявлення CD4+ і CD8+ клітин, зокрема для обстеження ВІЛ-інфікоованих людей.

Дана технологія є альтернативою проточної цитофлуориметрії, однак у порівнянні з візуальним стрептавідін-біотіновим методом вона має досить високу собівартість.

14.2.8. Реакція лімфоцитолізу

Даний метод призначений для виявлення клітин, на яких експресовані антигени гістосумісності (HLA- або MHC-антигени) того чи іншого типу, що може надати інформацію про генетичну схильність пацієнта певних хвороб. За допомогою цього метода були відкриті найбільш розповсюджені HLA-антигени. Реакція лімфоцитолізу була розроблена в 50-і роки і базується на тому, що живі клітини, які несуть HLA-антиген, після приєднання до нього антитіл антисироватки у присутності комплементу втрачають життєздатність. Оцінка кількості загиблих клітин дозволяє визначати число клітин цього типу. Антисироватки до HLA-антигенів отримують від добровольців, імунізованих цими антигенами.

Реакцію лімфоцитолізу ставлять у мікроваріанті тільки з чистою суспензією лімфоцитів. У лунки планшетки для мікротитрування вносять суспензію клітин, антисироватку до лімфоцитарних антигенів певного типу і комплемент. Суміш інкубують при 37°С, а потім фарбують трипановим синім і фіксують формальдегідом. За допомогою світлового мікроскопа підраховують кількість клітин, що втратили життєздатність, тобто пофарбованих. При точному дотримуванні умов ступінь відтворення цитотоксичного тесту досягає 95 %.

Реакцію лімфоцитолізу часто використовують для визначення антигенів HLA-DR, які експресуються лише на В-лімфоцитах, моноцитах і сперматозоїдах. В-лімфоцитів у крові відносно небагато, тому для одержання адекватних результатів реакцію проводять з очищеною суспензією В-лімфоцитів. Спочатку одержують моноядерні клітини шляхом центрифугування крові у градієнті щільності, потім проводять реакцію Е-розеткоутворення для виявлення Т-лімфоцитів. Клітини, що утворили Е-розетки, відділяють за допомогою повторного центрифугування у градієнті щільності. Очищені В-лімфоцити використовують для типіювання, проводячи цитотоксичний тест із відповідними антисироватками так, як описано вище. Результат типіювання оцінюють у залежності від кількості загиблих клітин.

Для визначення субпопуляцій лімфоцитів методом лімфоцитолізу використовують моноклональні антитіла. Необхідність працювати з чистою суспензією лімфоцитів, так само, як і при HLA-типіюванні, суттєво ускладнює описану технологію.