14.2.4. Люмінісцентно-серологічний метод

Цей метод за принципом практично не відрізняється від вже описаного нами метода імунофлюоресенції для виявлення розчинних антитіл або антигенів (див. Розділ 14.1.5. Імунофлюоресцентні методи). У даному випадку - при визначенні субпопуляцій лімфоцитів – використовують мічені флюорохромами антитіла проти відповідних CD-молекул або Ig-рецепторів лімфоцитів. В якості барвників найчастіше застосовують препарати флуоресціна (зелене світіння) або родаміна (червоне світіння). В основі метода лежить здатність імуноглобулінів зв’язуватись з флюорохромами без втрати антитільної активності.

Люмінісцентно-серологічний метод був достатньо розповсюджений у 60-80-і роки минулого сторіччя для виявлення імуноглобулінів на поверхні В-лімфоцитів, де вони містяться у великій кількості. Це дає можливість виявляти В-лімфоцити серед загальної популяції лімфоцитів. Для проведення даного методу з крові виділяють чисті лімфоцити з використанням градієнтів щільності, відділяючи їх від гранулоцитів, оскільки останні дають спонтанну люмінісценцію. Кон’югати антитіл і флуорохрома змішують із суспензією живих лімфоцитів і інкубують протягом 20-30 хв. Пофарбовані таким способом В-лімфоцити відмивають і прораховують кількість клітин, що дають світіння, з використанням флуоресцентного мікроскопа.

Якісне проведення даного метода технічно складне, вимагає високого ступеня очищення антитіл, мічених флюорохромом, постановки численних контролів, щоб виключити помилки, пов’язані з неспецифічним світінням клітин. Хоча на зміну даному методу прийшов більш сучасний метод проточної цитофлуориметрії, для лабораторій, які не мають проточних цитофлюориметрів, а є люмінісценнтний мікроскоп, люмінісцентно-серологічний метод зберігає свою практичну цінність.

14.2.5. Метод лазерної проточної цитофлуориметрії

Даний метод виник на базі люмінісцентно-серологічного метода завдяки створенню лазерних проточних цитофлюориметрів і почав поширюватись на початку 80-х років ХХ століття у зв’язку зі створенням гибрідомної технології одержання моноклональних антитіл до різних поверхневих антигенів клітин крові, що характерні для певних субпопуляцій. Лазерний проточний цитофлуориметр дозволяє за допомогою комп’ютерної технології ідентифікувати різні субпопуляції імуноцитів з урахуванням інтенсивності флюоресцентного світіння та їх розміру при проходженні у потоці рідини.

Цей метод – один із самих ефективних для клінічних досліджень, він дає стабільно відтворені результати при чіткому дотриманні інструкцій ходу аналіза і використання реактивів фірми-виробника.

За допомогою метода лазерної проточної цитофлюорометрії можна визначати поверхневі антигенні маркери лімфоцитів з використанням мічених моноклональних антитіл як у цільній крові, так і в окремих клітинних суспензіях, виділених з крові. Для здійснення даного методу невелику кількість капілярної крові з пальця (0,05 мл), змішаної з антикоагулянтом, инкубують з міченими флюрохромом моноклональними антитілами при 0⁰С протягом 15-30 хв. Потім проводять гемоліз еритроцитів, витримуючи їх з гемолітичною рідиною (0,83%-ний розчин хлористого амонію з домішкою ЕДТА) при 20°С протягом 40-60 сек. Контроль результатів реакції ведуть за допомогою лазерного проточного цитофлюориметра, ідентифікуючи клітини за розміром (популяції лімфоцитів, моноцитів і гранулоцитів) та за інтенсивністю світіння.

Найбільш широко метод проточної цитофлюорометрії застосовується для визначення рецепторів апоптоза нейтрофілів і лімфоцитів (CD95), що є найважливішим показником імуносупресії. Але можливості проточного цитофлюориметра при використанні широкого набору моноклональних антитіл досить широкі. Він дозволяє здійснівати виявлення внутрішньоклітинних і позаклітинних цитокінів, визначення активності натуральних кілерів, вивчення мобілізації кальцію, утворення активних форм кисню, надавати оцінку поглинальної здатності фагоцитів і їхньої бактерицидної активності, поглинання, переробки і презентації антигенів моноцитами, оцінку проліферативної активності лімфоцитів та ін.. Практичні всі інші імунологічні методи вивчення клітинного імунітету, можна замінити їх модифікаціями на лазерному проточному цитофлуориметрі.